Abstrakt

Biotechnologie-Kongress 2015: Natürliche Produkte von Anthracophyllum discolor: Ligninolytische Enzyme und antimykotische flüchtige Verbindungen - Heidi Schalchli - Universidad de La Frontera

Heidi Schalchli, Briceno G und Diez MC  

Weißfäulepilze spielen in Ökosystemen eine wichtige Rolle, vor allem aufgrund ihres extrazellulären Enzymsystems und ihrer Produktion chlorierter aromatischer Verbindungen, die als Zersetzer organischer Stoffe, Antibiotika zum Schutz von Pilzen, Methyldonatoren und/oder Substrate für H2O2-erzeugende Oxidasen wirken. In dieser Studie untersuchten wir die Produktion ligninolytischer Enzyme und pilzhemmender flüchtiger organischer Verbindungen (VOCs) durch A. discolor Sp4 unter Verwendung von Kartoffelschalen (PP) und weggeworfenen Kartoffeln (DP) als Nährstoffquelle. Die manganabhängige Peroxidase (MnP) wurde durch Überwachung der Oxidation von 2,6-Dimethoxyphenol bewertet. Neben der Produktion von MnP wurde mithilfe eines qualitativen Tests auch die Verfärbung von Remazol-Brilliantblau R (RBBR) ermittelt. Die pilzhemmende Aktivität der VOCs gegen Mucor miehei und Fusarium oxysporum wurde mithilfe eines Zweikammerplattentests bewertet. Schließlich wurden die aus den Myzelkulturen freigesetzten VOCs mittels Headspace-Festphasenmikroextraktion und Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert. Die höchsten MnP- und MiP-Aktivitäten (163 U L-1 und 24 U L-1) wurden am 15. Tag der Inkubation erreicht, und es wurde eine vollständige RBBR-Verfärbung beobachtet. Obwohl beide Kartoffelabfälle die ligninolytische Aktivität unterstützten, wurde bei Verwendung von PP eine höhere MnP-Aktivität erzielt als bei DP.

Die flüchtigen Bestandteile von A. discolor hemmten das Myzelwachstum von M. miehei auf PP-Agar- bzw. DP-Agar-Medien um etwa 62 % bzw. 76 %. Der Pflanzenpathogen F. oxysporum wurde jedoch leicht gehemmt (etwa 10 %). Die wichtigsten nachgewiesenen VOCs waren chlorierte aromatische Verbindungen (über 50 % relativer Anteil). Die erhaltenen Naturstoffe haben zahlreiche biotechnologische Anwendungen, darunter Schadstoffabbau und Pflanzenschutz. Parasitäre instabile Hilfsmetaboliten spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung feindlicher und nützlicher Beziehungen zwischen Lebensformen. Die Auswirkungen von acht Stämmen von Weißfäule-Organismen, die auf Kartoffelabfällen kultiviert wurden, auf das Myzelwachstum von Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum und Mucor miehei wurden mithilfe einer Petrischalenstudie mit zwei Kammern untersucht. Die synthetische Synthese von unvorhersehbaren organischen Verbindungen, die aus dem Stamm mit der bemerkenswertesten hemmenden Wirkung freigesetzt wurden, wurde zusätzlich durch Headspace-Festphasenmikroextraktion und Gaschromatographie/Massenspektrometrie-Analyse untersucht. Von den acht untersuchten Weißfäule-Wuchern zeigte Anthracophyllum stain. Sp4 eine hohe hemmende Wirkung gegen M. miehei (etwa 76 %) und B. cinerea (etwa 20 %). F. oxysporum wurde in geringerem Maße (etwa 10 %) durch A. stain und T. versiscolor gehemmt. Die Gaschromatographie-/Massenspektrometrie-Analyse ergab neun grundlegende, aus A. vulgare Sp4 freigesetzte volatile Verbindungen, darunter die Sesquiterpene α-Bisabolen und Bulnesen sowie die chlorierten süßlichen Verbindungen 1,5-Dichlor-2,3-dimethoxybenzol, 3,5-Dichlor-4-methoxybenzaldehyd und 3-Chlor-4-methoxybenzaldehyd. Einige davon wurden bereits zuvor mit antimikrobieller Wirkung beschrieben. Die antimykotische Wirkung und das instabile Profil von A. vulgare wurden bisher nicht beschrieben. Herbizide verursachen Umweltprobleme, da sie giftig sind und sich in der Natur, Nahrungsmitteln und Wasservorräten ansammeln. Es besteht die Notwendigkeit, sichere, wirksame und praktische Strategien zu entwickeln, um sie aus der Natur zu entfernen, in der Regel durch biologischen Abbau. Atrazin ist ein solches Herbizid. Weißfäuleparasiten können Herbizide von potenziellem Nutzen entwerten. Diese Studie definierte eine neuartige pelletierte Unterlage zur Immobilisierung des Weißfäule-Organismus Anthracophyllum vulgare, um seine Fähigkeit zur Zersetzung von Atrazin mithilfe eines Bioreinigungssystems (BS) zu verbessern. Verschiedene Mengen an Sägemehl, Stärke, Maismehl und Leinsamen wurden verwendet, um drei pelletierte Unterlagen (F1, F2 und F3) herzustellen. Außerdem wurde die Immobilisierung mit beschichteten und unbeschichteten pelletierten Unterlagen (CPS und UPS) untersucht. UPS-F1 wurde als das beste System identifiziert, da es ein hohes Maß an Manganperoxidase-Aktivität und parasitärer Funktionalität bot. Die Halbwertszeit (t1/2) von Atrazin verringerte sich sowohl für die Kontroll- als auch für die immunisierten Proben von 14 auf 6 Tage. Die Immunisierung mit immobilisiertem A. vulgare führte zu einer Zunahme der von der DGGE bewerteten und hinsichtlich der Phenoloxidase-Aktivität identifizierten infektiösen Taxa.Die Behandlung verbessert den Atrazinabbau und verringert die Verlagerung in Oberflächen- und Grundwasser.

Atrazin ist das am häufigsten verwendete Herbizid in Chile und vielleicht sogar weltweit (Mesquini et al. 2015) und wird vom Chemiegiganten Syngenta als Unkrautvernichter hergestellt. Es wird für Mais, Zuckerrohr und Sorghum verwendet und reduziert breitblättriges und grünes Unkraut während der Vor- und Nachkultivierung (Cabrera-Orozco et al. 2016). In der Europäischen Union wurde die Verwendung von Atrazin jedoch 2004 aufgrund seiner Konstanz im Grundwasser verboten. Der Kontakt mit Atrazin kann bei Land- und Wasserlebewesen Hermaphroditismus verursachen (Hayes et al. 2002). Auch die Bodenverunreinigung durch Pestizide wie Atrazin beim Befüllen von Sprühtanks kann schwerwiegende Umweltschäden verursachen (Castillo et al. 2008; Grigg et al. 1997; Lozier et al. 2012). Pestizide können auf natürliche Weise durch Mikroorganismen zerstört werden. In biotechnologischen Anwendungen werden Weißfäule-Parasiten (WRF) eingesetzt, um diesen biologischen Abbau zu erreichen (Morgan et al. 1993; Castillo et al. 2000, 2008). WRF produzieren extrazelluläre ligninolytische Katalysatoren, die eine breite Palette anderer organischer Verbindungen zerstören (Rubilar et al. 2012).

The most significant job of WRF is in nature where the life forms reusing dead plant material which would somehow or another amass in the earth making life on earth outlandish. The ligninolytic catalysts from WRF are one of a kind in that they can totally debase lignin to carbon dioxide and water. The ligninolytic chemicals incorporate lignin peroxidases (LiP, EC 1.11.1.14), manganese peroxidases (MnP, EC 1.11.1.13) and laccase (Lcc, EC 1.10.3.2). These catalysts can be incited by lignocellulosic mixes or other natural mixes and their creation is managed by the accessibility of supplements, temperature and inductors or inhibitors (Lorenzo et al. 2002; Rodríguez-Couto and Sanromán 2005; Baldrian 2008). The WRF Anthracophyllum stain produces ligninolytic catalysts and essentially MnP in nearness of contaminations, for example, chlorophenols, as pentachlorophenol (PCP), polycyclic fragrant hydrocarbons (PAHs) and engineered colors (Tortella et al. 2008; Elgueta and Diez 2010; Rubilar et al. 2011; Acevedo et al. 2011; Elgueta et al. 2012). The biopurification framework (BS) is a biological and practical innovation to diminish pesticide pollution of soil and water (Castillo and Torstensson 2007). The BS is made out of straw, peat and soil and its proficiency depends on the capacity to hold and debase pesticides by indigenous soil microorganisms. A few reports on the significance of microbial networks engaged with pesticide corruption in BS are accessible (Marinozzi et al. 2013). Studies have depicted the utilization of atomic strategies, for example, denaturing slope gel electrophoresis (DGGE) (Coppola et al. 2012; Marinozzi et al. 2013; Tortella et al. 2013). Coppola et al. (2012) portrayed a change in microbial decent variety after the expansion of pesticides and showed that yeasts and ascomycete filamentous parasites are associated with the pesticides corruption in BS. Tortella et al. (2013) assessed the microbial network structure during atrazine corruption in a BS and watched little effect.

Landwirtschaftliche und forstwirtschaftliche Abfälle, die als Lignozelluloseabfälle entstehen, erhöhen die Umweltverschmutzung stetig. Dies führt zum Verlust wichtiger natürlicher Verbindungen (Zellulose, Hemizellulose und Lignin), die in mehrere Produkte mit hohem Mehrwert umgewandelt werden können (Rodríguez-Couto et al. 2001; Sanchez 2009). Die Biotransformation von Lignozelluloseabfällen kann Mikroorganismen, insbesondere den WRF, zugeschrieben werden, da ihre extrazellulären ligninolytischen Proteine ??bereit sind, Lignin sowie organische Moleküle als Toxine anzugreifen und umzuwandeln (Rao et al. 2014). Die meisten Studien zur Atrazinabbauung umfassen bodenbasierte Systeme unter Verwendung von Mikroorganismen (Newcombe und Crowley 1999; Fan und Song 2014; Zhang et al. 2014). Einige Studien verwendeten jedoch WRF und Castillo et al. (2001) zeigten, dass P. chrysosporium in Strohkulturen in der Lage war, 91 % des Herbizids innerhalb von 14 Tagen nach dem Schlüpfen zu verdauen. Um diese Leistung auszunutzen, kann WRF in Lignozellulose-Blöcken immobilisiert werden, wodurch deren Überlebensfähigkeit in Sichtweite einheimischer Bodenbakterien erhöht wird (Pepper et al. 2002). Sägemehl wurde aufgrund seiner Fähigkeit, die parasitäre Verdauung zu unterstützen, als ideales Hilfsmittel vorgeschlagen (Walter et al. 2004; Smith et al. 2005). Die parasitäre Immobilisierung hat jedoch grundlegende Punkte, die die Überlebensfähigkeit von Pilzen im Boden beeinflussen können. Temperatur und Feuchtigkeit können den Erfolg der Bodenbioremediation unter Verwendung immobilisierter Pilze bestimmen (Walter et al. 2005; Schmidt et al. 2005; Ford et al. 2007).

Walter et al. (2004) fanden heraus, dass Weizenstroh und eine Sägemehl-Maismehl-Stärke-Mischung (SCS) ein geeigneter Träger für T. versicolor zur Bioremediation von PCP im Boden waren. Portage et al. (2007) bewerteten die PCP-Bioremediation durch T. versicolor (3–175 g kg−1 Inokulum) in stark verunreinigten Ackerböden (100–2137 mg kg−1 PCP). Sie fanden heraus, dass die Bioverfügbarkeit und Extrahierbarkeit von PCP im verunreinigten Boden nach der Bioaugmentation deutlich erhöht sein können. Darüber hinaus stellten Schmidt et al. (2005) eine starke Beziehung zwischen der Menge des verwendeten parasitären Inokulums von T. versicolor und der infektiösen Kolonisierung in einem zur Bioremediation bioaugmentierten Boden fest. Rubilar et al. (2011) haben die Fähigkeit von immobilisiertem A. vulgaris und P. chrysosporium auf Trägern mit Weizenstroh zur Bioremediation von mit PCP kontaminiertem Boden beschrieben. Diese Forscher stellten eine hohe Infektionswachstumsrate und MnP-Produktion fest. Die Immobilisierung in Weizenkörnern förderte die Ausbreitung von Pilzen im Boden und damit die Toxinabbauung um über 75 %. Das grundlegende Ziel der vorliegenden Studie war die Entwicklung eines pelletierten Trägers zur Immobilisierung von A. vulgaris und die Bewertung seiner Fähigkeit, das Atrazin mithilfe eines BS abzubauen.