Abstrakt

Biotechnologie-Kongress 2015: Verbesserung der Aktivität und Thermostabilität der Trametes versicolor IBL-04-Laccase durch Immobilisierung von Chitosankügelchen – Muhammad Asgher – Universität für Landwirtschaft

Muhammad Asgher und Sadia Noreen

 Das Laccase-Enzym findet in zahlreichen industriellen Prozessen Anwendung, darunter Delignifizierung von Biomasse, Biopulping für Papier und Zellstoff, als Steinwaschmittel für Denim, in Waschmitteln, zur Bioremediation und zur Entwicklung von Biosensoren. Die von Trametes versicolor IBL-04 in SSF von Maiskolben (911 U/ml) produzierte monomere 66 kDa Laccase wurde durch Ammoniumsulfatfällung, Dialyse, Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration gereinigt. Die gereinigte Laccase wurde mit Chitosan als Trägermaterial und Glutaraldehyd als Aktivator/Vernetzungsmittel immobilisiert. Eine Chitosankonzentration von 2,5 % war optimal zur Herstellung der stabilsten 2,0 mm großen Chitosankügelchen, die mit 1,5 % Glutaraldehyd für eine optimale Laccase-Immobilisierung aktiviert wurden. Rasterelektronenmikroskopie zeigte, dass die Kügelchen mit immobilisierter Laccase auf der Oberfläche eine kugelförmige Gestalt mit großer Oberfläche hatten. Die immobilisierte Laccase erwies sich als katalytisch stärker und stabiler und funktionierte in einem weiten pH-Bereich von 3–6 und einer Temperatur von 45–65 °C. Mit Chitosankügelchen immobilisierte Laccase hatte 936 U/ml bei pH 6 und 60 °C und zeigte ein verbessertes thermisches Verhalten. Die auf Chitosankügelchen immobilisierte Laccase hatte höhere Km- (93 μM) und V-max-Werte von 944 μM/min als ihr lösliches Gegenstück und zeigte somit ihre höhere katalytische Effizienz. Die kinetischen und thermostabilen Eigenschaften der auf Chitosankügelchen immobilisierten Laccase zeigen, dass das Enzym Potenzial für die Verwendung in der industriellen und Umweltbiotechnologie hat. Die Anordnung der Ligninmineralisierungsverbindungen von Weißfäule hat enorme synergistische Aussichten für die oxidative Bioremediation verschiedener schädlicher Gifte und zahlreiche andere mechanische Anwendungen. Die Immobilisierung ermöglicht die Wiederverwendung von Katalysatoren und macht sie zu modern bedeutsamen und konservativen Biokatalysatoren. Die Schizophyllum-Gruppe IBL-06 wurde zur Emission von Ligninperoxidase (LiP) im voraufgerüsteten Reifungsmodus von Maisstängeln im festen Zustand entwickelt. Im Rohkulturüberstand wurde eine hohe Ausbeute an Ligninperoxidase (1347,3 U/ml) festgestellt. LiP wurde durch ein vornormalisiertes vierstufiges Verfahren gefiltert (5,65-fach), das Ammoniumsulfatfraktionierung, Dialyse, DEAE-Zellulosepartikelaustausch und Sephadex G-100-Segmentchromatographie umfasste. Das 38 kDa große Einzelpolypeptid S. Gruppe IBL-06 LiP bewegte sich als einzelnes klares Band sowohl auf lokalen als auch auf SDS-PAGE-Gelen. Die raffinierte Verbindung wurde dann auf Chitosan-Kügelchen immobilisiert, die mit Glutaraldehyd (Vernetzer) aktiviert wurden. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurde zur Bestätigung der LiP-Bindung auf Chitosan-Kügelchen durchgeführt. Das größte Potenzial zur Entfärbung von Materialien (95,45 %) wurde bei 30 °C mit Chitosan-immobilisierten Chemikalien ohne hämolytische Schädlichkeit beobachtet. Die Chitosan-Kügelchen LiP blieben nach drei wiederholten Durchläufen zu etwa 70 % aktiv, was nach dem siebten Wiederverwendungsmuster schrittweise auf 35 % abnahm. Das immobilisierte LiP zeigte bessere Farbentfernungseigenschaften als freies LiP. Höhere Thermostabilität,Die niedrigeren Km- und hohen Vmax-Eigenschaften von immobilisiertem LiP mit Chitosanpunkten deuten auf seine Eignung für verschiedene biotechnologische und industrielle Anwendungen hin. Schlagworte: Schizophyllum-Kooperatives IBL-06, Ligninperoxidase, Immobilisierung von Chitosankügelchen, Darstellung, Farbentfärbung. Darstellung Die Katalysatoren sind stickstoffhaltige komplexe Proteinpartikel mit spezifischen synergistischen Eigenschaften, die von lebenden Zellen erzeugt werden, um dauerhaft benötigte biochemische Reaktionen zu katalysieren (Alam et al., 2009). Verbindungen haben hervorragende Eigenschaften wie synergistische Aktivität, hohe Selektivität und Spezifität. Trotz all dieser Eigenschaften haben sie auch einige Nachteile. Wie Löslichkeit in Reaktionsmedien, Wackeln, Thermostabilität, sodass es schwierig ist, Katalysatoren aus der Reaktionsmischung zurückzugewinnen (Chen et al., 2012). Aufgrund dieses Problems müssen einige Eigenschaften der Proteine ??vor ihrer Verwendung im industriellen Maßstab verbessert werden, um die Kosten eines Herstellungsverfahrens zu senken. Die Betriebssicherheit, Wiederverwendbarkeit und Regeneration von im industriellen Prozess eingesetzten Katalysatoren kann durch die Nutzung mutagener Effekte, genetisches Design und die Immobilisierung von Proteinen oder Prozessänderungen verbessert werden (Asgher et al., 2013a). Proteineigenschaften wie synergistische Wirksamkeit, Spezifität und verschiedene Verwendungsmöglichkeiten in neuartigen Formen ersetzen in Labors und in der Industrie zunehmend die herkömmlichen chemischen Verfahren. Die Vermarktung von Proteinen verläuft jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten und Kapazitätsprobleme langsamer (Asgher et al., 2013a; Shi et al., 2003). Immobilisierungstechniken helfen bei der Herstellung stabiler, wiederverwertbarer und wiederverwendbarer Chemikalien für vielseitige industrielle und ökologische Anwendungen, was erhebliche finanzielle Vorteile mit sich bringt (Asgher et al., 2008b). Die Eigenschaften immobilisierter Katalysatoren werden in der Regel von den chemischen Eigenschaften der Verbindung sowie dem Trägergitter beeinflusst (Wang et al., 2012). Die besonderen Bindungen zwischen Trägermaterial und Katalysator verleihen verschiedenen Chemikalien einzigartige biochemische, dynamische, mechanische und chemische Eigenschaften. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Immobilisierung von Proteinen (Verbindungen) sind Oberflächenadsorption, Adsorption und Verkapselung (Thakur et al., 2015). Dabei wird Verkapselung oder Verkapselung der Oberflächenadsorption vorgezogen, da sie einfacher, kostengünstiger und praktischer ist und die Struktur des Katalysators geschützt bleibt (Asgher et al., 2012c). Es wurden verschiedene Methoden zur Behandlung von industriellen Abwässern und Farbstoffverunreinigungen beschrieben, die weder wirtschaftlich noch umweltfreundlich sind. Diese Tatsachen erfordern zweifellos die Entwicklung einer effektiven, kostengünstigen und umweltfreundlichen Technologie zur Reinigung und Verunreinigung von industriellen Abwässern, die Farbstoffe enthalten. Die derzeit angewandten wesentlichen Strategien sind The Journal of Animal and Plant Sciences, 26(5): 2016, Seite: 1451-1463 ISSN: 1018-7081 Parveen et al., The J.Anim. Plant Sci. 26(5):2016 1452 zur Behandlung von Abwasser auf der Grundlage physikalischer oder chemischer Methoden, die unglaublich teuer sind und deren Sammlung von abgelagertem Abwasser zu Umweltkatastrophen führt (Alam et al., 2009; Parshetti et al., 2012). Biologisch abbaubare Verfahren bieten hingegen kostengünstige und umweltfreundliche Sanierungstechnologien und erzeugen keine großen Mengen an Abwasser (Bilal et al., 2015). Das Interesse an neuen Biokatalysatorverfahren ist in den letzten zwei Jahrzehnten aufgrund der zunehmenden Verwendung von Xenobiotika gestiegen. Die Vergärung dieser Chemikalien ist mit herkömmlichen chemischen Verfahren nicht wirksam und effizient (Missau et al., 2014). Die Basidiomyceten; Weiße Fäulnispilze (WRF) sind die kleinräumigen Lebewesen, die allgemein für die moderne Farbverfälschung verantwortlich sind. Ohne Erfolgsgarantie werden die ligninolytischen Chemikalien (LiP, MnP, Lac) des WRF während der Entfärbung freigesetzt (Cheng et al., 2007; Maciel et al., 2010). LiP hat ein enormes Redoxpotenzial und ein breites Anwendungsspektrum in verschiedenen mechanischen Verfahren. Raffiniertes LiP aus Kocuria rosea zeigte eine höhere synergistische Wirkung bei der Entfärbung reagierender Farben durch verschiedene Ansammlungen, was zeigt, dass es eine unglaublich flexible Peroxidase ist (Qiu et al., 2009). Biografie Muhammad Asgher ist Vorsitzender der Abteilung für Biochemie an der University of Agriculture in Faisalabad. Er schloss sein Studium 1985 in Gujranwala ab und erlangte 1988 seinen MSc, 1993 seinen Mphil und 1998 seinen PhD im Fach Biochemie an der University of Agriculture in Faisalabad, Pakistan. 2002 erhielt er das UNESCO-Stipendium für Biotechnologie und 2004 ein einjähriges HEC-Postdoktorandenstipendium, um an der University of Waterloo, Kanada, an der Produktion, Reinigung und Immobilisierung von industriellen Enzymen zu arbeiten. 2009 verlieh ihm die HEC ein Sabbatical Leave Fellowship, um an der University of Waterloo, Kanada, fortgeschrittene Enzymimmobilisierungstechniken zu erlernen. Nach weiteren 5 Jahren erhielt er ein Sabbatical Research Fellowship vom Biotechnology Lab der University of Waterloo, Kanada, für gemeinsame Forschung und Ausbildung zur Produktion und Charakterisierung von Biokompositen. Er hat außerdem 2 nationale und 5 internationale Postgraduierten-Forschungstrainingskurse absolviert. Er kam 1990 als Dozent für Biochemie an die University of Agriculture in Faisalabad, Pakistan. Aufgrund seiner herausragenden akademischen Leistungen wurde er 1999 zum Assistenzprofessor, 2004 zum außerordentlichen Professor, 2007 zum Professor und 2010 zum Professor TTS ernannt. Er betreute die Postgraduiertenstudenten bei der Forschung und hat bisher als Hauptbetreuer 124 Forschungsstudenten hervorgebracht, darunter 10 PhD-, 36 MPhil- und 78 MSc-Studenten, um der Industrie und der Wissenschaft ausgebildete Arbeitskräfte zur Verfügung zu stellen. Als Forscher konzentrierte er seine Untersuchungen auf die einheimische Produktion, Reinigung, Charakterisierung und Immobilisierung mikrobieller Enzyme und ihre industriellen Anwendungen.Er hat eine Reihe von Forschungsprojekten als PI und Co-PI gewonnen und durchgeführt.