Abstrakt

Biotechnologie-Kongress 2015: Rekombinantes sFRP1 in der Krebs-Theranostik - Archita Ghoshal - Indian Institute of Technology Guwahati

Archita Ghoshal und Siddhartha Sankar Ghosh

Der Wnt-Signalweg ist ein kritischer Aspekt im komplexen Netzwerk von Signalmolekülen, die an Krebs beteiligt sind. In nicht malignen Zellen wird die Wnt-Signalkaskade durch die mit dem Secreted Frizzled verwandten Proteine ??(sFRPs), eine Familie von Glykoproteinen, blockiert. In Krebszellen werden sie jedoch epigenetisch stummgeschaltet. In dieser Studie haben wir versucht, rekombinantes menschliches sFRP1, das aus Bakterienkulturen isoliert wurde, auf Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) zu verabreichen, um seine Antikrebsaktivität zu bestimmen. Das menschliche sFRP1-Gen wurde in den bakteriellen Expressionsvektor pGEX-4T2 kloniert. Rekombinantes Protein wurde als Einschlusskörper in E.coli BL21 (DE3) überexprimiert. Nach Optimierung des Prozesses der Solubilisierung von Proteinen mithilfe von Detergenzien wurde GST-sFRP1 durch Glutathion-Agarose-Affinitätschromatographie bis zur Homogenität gereinigt. Die MALDI-Analyse bestätigte die für GST-sFRP1 spezifische Peptidsignatur und die strukturelle Integrität wurde durch Zirkulardichroismus-Spektren charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass gereinigtes rekombinantes Protein in nanomolaren Konzentrationen eine signifikante antiproliferative Wirkung auf HeLa-Zellen ausübt. Western Blotting mit Antikörpern gegen Beta-Catenin und phosphoryliertes Beta-Catenin bestätigte die Implikation des kanonischen Wnt-Signalwegs. Die Kombinationstherapie zeigte, dass rekombinantes sFRP1 HeLa-Zellen gegenüber dem herkömmlichen Chemotherapeutikum Cisplatin erheblich chemosensibilisierte. Die Beschichtung des therapeutischen Proteins über in Gold-Nanocluster eingebettete neuartige zusammengesetzte Nanopartikel erleichterte die anhaltende Freisetzung des Proteins und verbesserte seine funktionelle Aktivität. Die bemerkenswerte Fluoreszenzeigenschaft von Gold-Nanoclustern wurde für Tracking- und Bildgebungszwecke ausgenutzt. Insgesamt könnte sich das auf therapeutischem sFRP1 basierende Nanosystem als revolutionär auf dem Gebiet der Krebs-Theranostik erweisen. Das emittierte Frizzled-Related Protein 1 (SFRP1) ist ein charakteristischer Blocker des Wnt-Flagging-Signalwegs in normalen erwachsenen Zellen, wird jedoch in Krebszellen epigenetisch unterdrückt, was zu abweichendem Wachstum führt. In dieser Studie haben wir neuartige zusammengesetzte Nanopartikel entwickelt, die aus mit Goldnanoclustern bestückten Chitosan- und Alginatmolekülen hergestellt und an bakteriell übertragenes menschliches rekombinantes sFRP1 gebunden sind. Der Wnt-Signalweg, der bei Krebs hochreguliert ist, wurde mit den Nanopartikeln gezielt angesteuert, um eine antiproliferative Wirkung auf Krebszellen zu erzielen, wie aus verringerten Konzentrationen nachgeschalteter Moleküle, nämlich β-Catenin, Cyclin D1 und Survivin, hervorgeht. Die Nanopartikel ermöglichten eine verstärkte Freisetzung von sFRP1 außerhalb der Zellen, wo es praktisch ist. Außerdem wurden die erstaunlichen Schillereigenschaften von Goldnanoclustern für wissenschaftliche, bildgebende und Nachuntersuchungen genutzt. Die gleichzeitige Behandlung von mit sFRP1 bestückten Nanopartikeln mit dem Medikament Cisplatin zielte auf zwei freie Signalwege zur Induktion der Apoptose ab, wie durch auf Durchflusszytometrie basierende Studien belegt wurde. Insgesamt ist dieses Nanosystem vielversprechend für die Verfolgung, Bildgebung und Fokussierung auf die Krebsentwicklung mit therapeutischem Protein.Das sekretierte frizzled-related protein 1 (SFRP1) ist ein charakteristischer Blocker des Wnt-Signalwegs in normalen erwachsenen Zellen, wird jedoch in Krebszellen epigenetisch unterdrückt, was zu einer abnormalen Vermehrung führt. In dieser Studie haben wir neuartige zusammengesetzte Nanopartikel vorgestellt, die aus mit Goldnanoclustern ausgestattetem Chitosan und Alginat hergestellt und an bakteriell übertragenes menschliches rekombinantes sFRP1 gebunden sind. Der bei Krebs hochregulierte Wnt-Signalweg wurde mit den Nanopartikeln gezielt angesteuert, um eine antiproliferative Wirkung auf Krebszellen zu erzielen, was an verringerten Konzentrationen nachgeschalteter Moleküle, insbesondere β-Catenin, Cyclin D1 und Survivin, erkennbar ist. Die Nanopartikel ermöglichten eine kontinuierliche Freisetzung von sFRP1 außerhalb der Zellen, wo es praktisch ist. Darüber hinaus wurden die überraschenden Leuchteigenschaften der Goldnanocluster für wissenschaftliche, bildgebende und Nachuntersuchungen genutzt. Die gleichzeitige Behandlung von sFRP1-beladenen Nanopartikeln mit dem Medikament Cisplatin zielte auf zwei freie Wege zur Aktivierung der Apoptose ab, wie Untersuchungen auf der Grundlage von Durchflusszytometrie zeigten. Insgesamt ist dieses Nanosystem vielversprechend für die Verfolgung, Bildgebung und Fokussierung der Krebsbewegung mit nützlichem Protein. Der Wnt-Signalweg spielt eine dominierende Rolle bei der abweichenden Vermehrung bei einer Reihe von Krankheiten. In nicht-krebserregenden Zellen werden Wnts durch die emittierten frizzled-verwandten Proteine ??(sFRPs) blockiert, die in Krebszellen im Allgemeinen herunterreguliert sind. Wir haben bakteriell übertragenes Glutathion-S-Transferase-markiertes SFRP4 aus einem neuen Klon, der aus der Wurzel menschlicher Zellen gewonnen wurde, verfeinert und beschrieben. Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) und Lungenkrebszellen (A549), bei denen Wnt und verwandte Gene als spezifisch angesehen wurden, wurden mit dem desinfizierten rekombinanten sFRP4 behandelt, das eine signifikante Hemmung des Zellwachstums von bis zu 40 % aufdeckte. Die vorliegende Studie zur Wirksamkeit dieses bakteriell erzeugten rekombinanten sFRP4 bei der Erfassung der Zellteilung von Krebszellen ist die erste ihrer Art, bei der die Erfassung der G2/M-Phase und die frühe Apoptose nachgewiesen wurden. Die Zunahme des phosphorylierten β-Catenins bei der Behandlung mit sFRP4 zeigte eine Hemmung des Wnt-Signalwegs, die zusätzlich durch die Herunterregulierung generischer proliferativer Gene, insbesondere Cyclin D1, c-myc und Survivin, bestätigt wurde. Die funktionelle Wirkung des rekombinanten sFRP4 wurde zusätzlich in einem Co-Behandlungsmodul mit Chemotherapeutika missbraucht, um nukleare Ereignisse zu entwirren. Insgesamt ist unsere Forschung an gereinigtem rekombinantem sFRP4 aus bakteriellen Wirten sehr vielversprechend, um Wnt-Signale gezielt zu nutzen, um neue Strategien zur Krebsbekämpfung zu entwickeln. Vor kurzem haben wir die genomische Region 8p11†12 auf Veränderungen in der Reproduktionszahl und der Expressionsqualität in einer Reihe menschlicher Brustkrebszelllinien und Schlüsselproben untersucht. Wir haben festgestellt, dass SFRP1 (Secreted Frizzled Related Protein 1) selbst bei Brustkrebs mit Reproduktionszahlsteigerungen in dieser genomischen Region oft unterrepräsentiert ist.SFRP 1 kodiert einen WNT-markierenden Feind und spielt eine Rolle bei der Entwicklung verschiedener Arten von chronischen Tumoren. In dieser Studie analysierten wir die mit der Methylierung verbundene Stilllegung des SFRP1-Gens in Brustkrebszellen mit dem 8p11†12-Amplikon und untersuchten die tumorstillenden Eigenschaften von SFRP1 in Brustkrebszellen. Die SFRP1-Expression war sowohl in den Brustkrebszelllinien als auch in den essentiellen Tumorproben im Vergleich zu typischen essentiellen menschlichen Brustepithelzellen deutlich reduziert, selbst wenn SFRP1 erhöht wurde. Die Verdeckung der SFRP1-Expression in Brustkrebszellen mit einer SFRP1-Generhöhung ist mit der Methylierung des SFRP1-Werbemittels verbunden. Darüber hinaus hemmte die Wiederherstellung der SFRP1-Expression das Wachstum von Brustkrebszellen in Monoschichten und behinderte das Verankern des autonomen Wachstums. Wir untersuchten auch die Beziehung zwischen der Stilllegung der SFRP1-Expression und der WNT-Bewegung bei Brustkrebs. Die ektopische SFRP1-Expression in Brustkrebszellen unterdrückte sowohl autoritative als auch nichtkanonische WNT-Signalwege, und die SFRP1-Expression war negativ mit der Freisetzung einer Untergruppe von WNT-reaktiven Signalwegen, darunter RET und MSX2, verbunden. Daher kann die Herunterregulierung von SFRP1 durch epigenetische oder möglicherweise genetische Ereignisse ausgelöst werden und kann zur Tumorentstehung von Brustkrebs beim Menschen durch sowohl autoritative als auch nichtkanonische WNT-Signalwege beitragen. © 2009 UICCDie Herunterregulierung von SFRP1 kann durch epigenetische oder möglicherweise genetische Ereignisse ausgelöst werden und kann über sowohl herkömmliche als auch nicht-kanonische WNT-Signalwege zur Tumorentstehung von Brustkrebs beim Menschen beitragen. © 2009 UICCDie Herunterregulierung von SFRP1 kann durch epigenetische oder möglicherweise genetische Ereignisse ausgelöst werden und kann über sowohl herkömmliche als auch nicht-kanonische WNT-Signalwege zur Tumorentstehung von Brustkrebs beim Menschen beitragen. © 2009 UICC