Abstrakt

Biotechnologie-Kongress 2015: SeleKom M – selektive Kompartimentmembran: Herstellung und Charakterisierung von Nanodiscs für nanoskalige biomimetische Membranen - Ramona Bosch - Universität Hohenheim

Ramona Bosch

Nanodiscs sind nanogroße, scheibenförmige Phospholipid-Doppelschichten, die von stabilisierenden amphipathischen, helikalen Membrangerüstproteinen (MSP) umgeben sind. Zur Synthese der Nanodiscs wird das Membrangerüstprotein MSP1D1 verwendet (ein gentechnisch verändertes, biotechnologisch produziertes Derivat des humanen Apolipoproteins A-1). In den letzten Jahren hat die Verwendung dieser rekonstruierten Membranen mit eingebetteten Proteinen zunehmend an Bedeutung gewonnen, z. B. für die Untersuchung membranassoziierter Proteine. In den bekannten Studien werden Nanodiscs zusammengesetzt, indem einem wässrigen System, das die MSPs enthält, eine Mizellen-organisierte Detergens-Phospholipid-Mischung zugegeben wird. Nach Entfernung des Detergens bilden sich Partikel mit einem Durchmesser von 10 nm. Leider sind die resultierenden Nanodiscs in dieser Lösung ungeordnet, sodass eine einfache und weitere Verarbeitung zu einer geordneten und gerichteten Membran nicht ohne weiteres möglich ist. Ziel dieser Arbeit ist es daher, biomimetische Membranen bestehend aus vernetzten Nanoscheiben mit dem Translokon SecYEG als eingebettetem Proteinkomplex für einen aktiven biologischen Transport potenzieller Zielproteine ??herzustellen. Dieser Ansatz soll nun durch eine kontinuierliche Synthese ersetzt werden, die sich auf biomimetische aktive Nanoscheibenmembranen konzentriert. Im Vergleich zur zuvor beschriebenen Methode wird die Synthese in einem wässrig-organischen Zweiphasensystem ablaufen, wobei die erforderlichen Komponenten wie MSPs und Phospholipide kontinuierlich zugegeben werden. Die Phospholipide sammeln sich als amphiphile Moleküle in der Grenzschicht an und die MSPs sind in der hydrophoben Schicht lokalisiert. Wie bei der diskontinuierlichen Synthese wird angenommen, dass das richtige MSP-Phospholipid-Verhältnis durch spontane Anordnung der Nanoscheiben zustande kommt. Diese planar ausgerichteten Nanoscheiben werden über Cysteine ??vernetzt, die sich in den Membrangerüstproteinen befinden. Diese Cysteine ??dienen als Querverbindungen für die Disulfidbrücken. Die resultierende Membran ermöglicht eine gezielte Untersuchung von Membranproteinen, und daher haben biomimetische Membranen, die aus kreuzverbundenen Nanoscheiben bestehen, die Aussicht, als hervorragendes biotechnologisches Werkzeug zu dienen und können in der Erforschung gezielter membrangebundener Proteine ??sowie in der Methodenentwicklung für die selektive Trennung oder den Transport von Biomolekülen eingesetzt werden. Membranproteine ??werden von einer enormen Vielfalt an Größen, Strukturen und Funktionen repräsentiert, einschließlich komplexer supra-subatomarer mehrstufiger Ansammlungen, wobei viele Proteine ??komplexe subatomare Maschinen bilden. Sie führen die wichtigsten Zellfunktionen aus, einschließlich oxidativer Phosphorylierung und Protonenabsaugung, ATP-Bindung, Transport von Metaboliten, Markierung innerhalb und außerhalb der Zelle, Membranbindung und Kommunikation zwischen Zellkompartimenten, die Biosynthese zahlreicher Verbindungen, einschließlich Lipiden, Steroidhormonen und deren Tochtergesellschaften, und den Abbau von Xenobiotika und inneren Metaboliten. Formative Prozesse, einschließlich Zellmotilität, Bindung, Erkennung,Die neuronale Struktur und viele andere wichtige Ereignisse werden vollständig von Schichtproteinen gesteuert. Schichtproteine ??stellen die primäre Erkennungs- und Abwehrlinie für die Reaktion der Zelle auf Verletzungen, Umweltbelastungen und Virusinfektionen dar und sind direkt an vielen anderen Prozessen beteiligt, die für die Zellfunktion von entscheidender Bedeutung sind. Die Biophysik, organische Chemie, Grundlagenforschung und Zellwissenschaft von Schichtproteinen stellen einen breiten und wichtigen Teil der modernen Biowissenschaftsforschung dar. In den letzten 15 Jahren wurden vier Nobelpreise für die Entdeckungen auf dem Gebiet der Schichtproteine ??verliehen: 2003 und 2012 in Naturwissenschaften und 2004 und 2013 in Physiologie und Medizin. Die Untersuchungen zur Schichtbiophysik und organischen Chemie sind umfangreich und umfassen grundlegende Untersuchungen unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden, Versuche, allgemeine Faktoren und physiologisch bedeutsame Wechselwirkungen aufzudecken, die Bestimmung der Präferenz und Selektivität von Ligandenoffizieren, sowohl als Substrate als auch als allosterische Modulatoren, Ziele zum Verständnis der Wissenschaft der enzymatischen Katalyse, des Konzepts der Energieübertragung und der Erzeugung von Motilität sowie der Produktion von Molekülen und Atomen durch Transporter und Stationen. Häufig werden diese grundlegenden Zellfunktionen durch supra-subatomare Strukturen aus Protein, Lipid und Nukleinsäure gesteuert, beispielsweise jene Systeme bei der lichtsammelnden Photosynthese, der Nukleinsäure- und Proteinpolymerfusion, der Erkennung und Bewegung von Mikroorganismen und eukaryotischen Zellen und der Kommunikation zwischen Kompartimenten. Einige dieser Eigenschaften können mithilfe gereinigter Proteine ??ohne Lipiddoppelschicht untersucht werden, entweder in Reinigern oder anderen nicht-doppelschichtigen Mimetika, um eine Totalisierung zu vermeiden. Viele der für die Funktion von Membranproteinen und deren Strukturen grundlegenden Aspekte hängen jedoch eindeutig von Protein-Lipid-Kommunikationen ab, und im Allgemeinen bestimmt der Film einen wesentlichen Teil ihrer Funktion. Die meisten Membranproteine ??werden denaturiert oder zeigen eine veränderte Aktivität, wenn sie aus ihrer lokalen Doppelschicht entfernt werden. Bestimmte Lipide werden für filmspezifische Prozesse benötigt, beispielsweise für den Blutgerinnungsprozess, der durch Kontakt mit einer anionischen Oberfläche aktiviert wird. Die regulatorische Rolle von Cardiolipin in der Funktion bestimmter Transporter, die Rolle von Phosphoinositiden bei der Registrierung von Aktivierungsproteinen, die die Bildung zentraler Klammern bei der Zellbewegung steuern, und die Bildung komplexer Signalstrukturen, die durch elektrostatische Variablen vermittelt werden, sind nur einige Beispiele. Eine ordnungsgemäße Untersuchung dieser Systeme erfordert explorative Strategien, die Messungen im Hinblick auf Lipiddoppelschichten ermöglichen oder diese durch andere filmmimetische Systeme ersetzen.1–8 Bisher war dies auf die Verwendung von Vesikeln und Liposomen beschränkt, da diese eine innere gegenüber einer äußeren Kompartimentierung und eine enorme Doppelschichtregion bieten, die die Portabilität verschiedener Proteine ??und Lipide ermöglichen kann.wenn eine Dispersion oder Bildung von Multiproteinstrukturen erforderlich ist. Es gibt jedoch viele Herausforderungen bei der Verwendung von Vesikelsystemen. Im Allgemeinen sind die resultierenden Proben trüb, klebrig, über längere Zeiträume instabil, beschleunigen sich und neigen dazu, sich in phasengetrennte Bereiche zu isolieren, sowohl hinsichtlich der Stückheterogenität als auch der sekundären Heterogenität. Die ausführliche Beschreibung von Liposomen und Vesikeln wird in diesem Beitrag nicht untersucht. Bizellen und ähnliche erweiterte Doppelschichtstrukturen wurden erfolgreich in einigen NMR-Anwendungen eingesetzt, obwohl die Schwierigkeit, die Größe zu kontrollieren und eine Fusion zu vermeiden, manchmal problematisch ist.9,10 Angesichts dieser Einschränkungen haben Nanodiscs11,12 eine alternative Methode bereitgestellt, die submolekulare Analysen und strukturfunktionale Analysen von Filmproteinen ermöglicht hat. Nanodiscs sind heute eine allgemein anerkannte Methode zur Entscheidungsfindung für eine große Bandbreite biophysikalischer und biochemischer Analysen. Darüber hinaus ermöglichen Nanodiscs, wie in dieser Übersicht erläutert wird, die Erzeugung einer stabilen Bibliothek löslicher Nanopartikel, die das Membranproteom zuverlässig widerspiegeln und daher in Hochdurchsatz-Screening- und indikativen Anwendungen Verwendung finden. Indem sie resistenten Membranproteinen ein Zuhause bietet, hat die Nanodisc-Technologie auch breite Anwendung in der Ablösung, Reinigung und Solubilisierung von Membranproteinen für präparative und diagnostische Verfahren gefunden. Wie ebenfalls erläutert wird, haben Nanodiscs direkte Anwendung in der medizinischen Verabreichung und bei der Entwicklung kontrollierter Immunreaktionen gefunden.Die Nanodisc-Technologie wird auch häufig zum Ablösen, Reinigen und Solubilisieren von Filmproteinen für präparative und analytische Verfahren eingesetzt. Wie ebenfalls erläutert wird, werden Nanodiscs auch in der medizinischen Übertragung und bei der Erzeugung kontrollierter Immunreaktionen eingesetzt.Die Nanodisc-Technologie wird auch häufig zum Ablösen, Reinigen und Solubilisieren von Filmproteinen für präparative und analytische Verfahren eingesetzt. Wie ebenfalls erläutert wird, werden Nanodiscs auch in der medizinischen Übertragung und bei der Erzeugung kontrollierter Immunreaktionen eingesetzt.