Guido Krupp
Zusammenfassung: Die Verfügbarkeit hochwertiger synthetischer mRNAs (syn-mRNAs) hat Fortschritte bei ihren Anwendungen ermöglicht. Das wachsende Interesse privater Investoren und der Pharmaindustrie hat ein neuartiges Milliardengeschäft entstehen lassen. In seltener Ausnahmesituation sind zwei deutsche Unternehmen unter den drei führenden Unternehmen in diesem Bereich. Amptec sieht sich in der Pflicht, neue Akteure durch maßgeschneiderte, qualitativ hochwertige mRNA-Produkte zu unterstützen. Anforderungen bei der Anwendung der mRNA-vermittelten Zellmanipulation waren (i) die Expression von Antigenen in dendritischen Zellen für Impfungen bei Onkogenese, Infektionskrankheiten und Allergieprävention; (ii) die Umprogrammierung von Fibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen mit anschließender Differenzierung zum gewünschten Zelltyp; (iii) Anwendungen in der Gentherapie. In einem aktuellen Überblick werden Anwendungen und die entsprechenden Qualitätsanforderungen für syn-mRNA dargestellt. Syn-mRNAs können mittels In-vitro-Transkription (IVT) aus Vorlagen erzeugt werden, die das synthetische Gen enthalten. Grundsätzlich können linearisierte Plasmide als Vorlagen verwendet werden. Dieses Verfahren ist jedoch mit mehreren Nachteilen behaftet, wie z. B. unvollständige Plasmidspaltung, die zu schlechter Reproduzierbarkeit führt, und große Mengen an Plasmid-DNA, die unerwünschte bakterielle Komponenten einführen und zu Komplikationen bei In-vivo-Anwendungen führen können. Darüber hinaus hängt eine optimale mRNA-Aktivität von einem sehr langen, unmaskierten Poly(A)-Schwanz ab, der idealerweise 120 Nukleotide lang ist. Lange homopolymere Wiederholungen sind jedoch in Bakterienzellen instabil. Wir haben ein alternatives Verfahren mit gut definierten PCR-Produkten als IVT-Vorlagen entwickelt. Dieser Ansatz und detaillierte Qualitätsanforderungen für synthetische mRNAs werden vorgestellt. Probleme, die bei der IVT-basierten mRNA-Synthese beobachtet wurden, werden zusammen mit Problemlösungen gezeigt. Angesichts der entwickelten oder bakteriellen Nukleasen hat die Verbesserung der genomverändernden Fortschritte die Möglichkeit eröffnet, sich legitim auf genomische Abfolgen in praktisch allen eukaryotischen Zellen zu konzentrieren und diese anzupassen. Die Genommanipulation hat unsere Fähigkeit erweitert, den Zusammenhang zwischen genetischen Merkmalen und Krankheiten zu erklären, indem sie die Entwicklung immer präziserer Zell- und Tiermodelle neurologischer Prozesse vorangetrieben hat, und hat begonnen, in einer Vielzahl von Bereichen, von der Grundlagenforschung bis hin zur angewandten Biotechnologie und biomedizinischen Forschung, außergewöhnliches Potenzial zu zeigen. Die laufende Entwicklung programmierbarer Nukleasen, wie Zinkfingernukleasen (ZFNs), Interpretationsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs) und gebündelte routinemäßig interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas-verwandte Nukleasen, hat die Entwicklung der Genommanipulation von der Idee zur klinischen Praxis enorm beschleunigt. Hier untersuchen wir die laufenden Fortschritte der drei wichtigsten Genommanipulationstechnologien (ZFNs, TALENs und CRISPR/Cas9) und diskutieren die Verwendung ihrer Tochterreagenzien als Instrumente zur Genommanipulation bei verschiedenen menschlichen Krankheiten und potenziellen zukünftigen Behandlungen, wobei wir uns auf eukaryotische Zellen und Tiermodelle konzentrieren. SchließlichWir geben einen Überblick über die klinischen Studien zur Anwendung genomverändernder Verfahren zur Behandlung von Krankheiten und einige der Herausforderungen bei der Umsetzung dieser Technologie. Im Laufe der letzten Jahre hat die rasante Entwicklung der Genomverändernden Verfahren die Erforschung des menschlichen Genoms verändert, was es Forschern ermöglicht hat, die Bedeutung eines einzelnen genetischen Produkts für eine Krankheit eines Lebewesens besser zu verstehen. In den 1970er Jahren eröffnete die Entwicklung der genetischen Programmierung (Kontrolle von DNA oder RNA) neue Möglichkeiten der Genomeditierung.1 Genomeditierende Technologien auf Basis von genetischen oder bakteriellen Nukleasen haben sich in den letzten Jahren rasant entwickelt und zeigen in verschiedenen Bereichen, von der Grundlagenforschung bis hin zur angewandten Biotechnologie und biomedizinischen Forschung, einen ungewöhnlichen Nutzen.2 Genomeditierungen können in vitro oder in vivo durch die Bereitstellung der modifizierenden Hardware in situ durchgeführt werden, die effizient Merkmale hinzufügt, entfernt und „korrigiert“ sowie andere hochzielgerichtete genomische Modifikationen durchführt.3,4 Gezielte DNA-Modifikationen beginnen mit der Erzeugung von nukleaseaktivierten doppelten verlassenen Brüchen (DSBs), die zur Anregung hocheffizienter Rekombinationselemente der Zell-DNA in Säugetierzellen führen.5,6 Nuklease-induzierte DNA-DSBs können durch eines der beiden Hauptinstrumente repariert werden, die in fast allen Zelltypen und Lebewesen vorkommen: homologiekoordinierte Reparatur (HDR) und nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ),7 die in gezielten Integrationen oder Sequenzunterbrechungen auftritt. Tatsächlich war die homologe Rekombination (HR), bei der intakte homologe DNA-Stücke als Vorlagen verwendet werden, die Methode zur Erkennung gezielter Sequenzerweiterungen, -substitutionen oder -inaktivierungen. Der Nutzen der HR ist jedoch aufgrund ihrer Instabilität in Säugetierzellen und Modellorganismen stark eingeschränkt.8 Nachdem festgestellt wurde, dass DSBs die Häufigkeit von HDR um mehrere signifikante Grade erhöhen können, wurden gezielte Nukleasen als alternative Methode zur Steigerung der Effizienz von HDR-intervenierten genetischen Modifikationen entdeckt. Wenn ein gezielter DSB erstellt wurde, kann HDR die abgetrennte DNA mithilfe eines exogenen DNA-Layouts wiederherstellen, das für die Gruppierung der Bruchstelle geeignet ist. Diese Funktion kann verwendet werden, um spezifische Modifikationen zu erzeugen, indem ein richtig strukturiertes Reparaturlayout direkt in gezielten Zellen9,10 auf eine ortsspezifische Weise übertragen wird, was zu einer Modifikationsänderung oder einer neuen Sequenzeinfügung führt. Andererseits führt eine durch NHEJ vermittelte Reparatur tendenziell zu Fehlern, da sie zu einer effizienten Anordnung von Sequenzeinschlüssen oder -löschungen (Indels) unterschiedlicher Länge an der DSB-Stelle führt, was letztendlich zur Sequenzinaktivierung führt.11 Wenn Indels im Codierungskomplex auftreten, kommt es zu Frameshift-Transformationen, die durch durch Babble vermittelten Zerfall zu einer Beschädigung der mRNA oder einer nicht funktionalen verkürzten Proteinproduktion führen.12 Diese Methode und ihre Anwendungen gelten als einfacher als auf HR basierende Techniken, da (a) kein festes Netzwerk erforderlich ist und (b) der Zelltyp einen geringeren Einfluss auf die Effektivität der Modifikation hat (trotz HR kann NHEJ während des gesamten Zellzyklus aktiv sein).13 Daher kann NHEJ wie RNAi in vergöttlichten Zelllinien eingesetzt werden, um die Inaktivierung eines einzelnen Gens oder mehrerer Gens zu bewirken. Durch die Durchführung von Modifikationen, die den Funktionsverlust zur Folge haben, kann es jedoch zu einer dauerhaften Inaktivierung des Gens führen.9 In der frühen Entwicklungsphase der Genommodifizierung stand die Bildung spezifischer Zinkfingernukleasen (ZFNs)14 oder Meganukleasen15 im Mittelpunkt der Forschung, um an allen spezifischen Zielstellen der DNA die richtigen DSBs zu initiieren. Diese Nukleasesysteme erforderten besondere Fähigkeiten zur Erzeugung von künstlichen Proteinen, die aus DNA-spezifischen, variablen Sequenzen bestehen, die jeweils mit einer spezifischen Nuklease zur Zielspaltung verbunden sind, wodurch Wissenschaftler hervorragende Werkzeuge für genetische Manipulationen erhielten.16 In der Folgezeit hat eine neue Klasse von Flavobacterium okeanokoites (FokI)-Reaktantenbereichen, die aus bakteriellen Proteinen gewonnen wurden, die so genannten Translationsaktivator-ähnlichen Effektoren (TALEs), Einblicke in zusätzliche Möglichkeiten zur präzisen Genombearbeitung gegeben.17 TALE-basierte programmierbare Nukleasen können jede DNA-Gruppe von Interesse mit relativ hoher Häufigkeit durchtrennen. Die grundlegenden Schwierigkeiten bei Ansätzen mit Translationsaktivator-ähnlichen Effektor-Nukleasen (TALEN) sind jedoch das Design eines komplexen nuklearen Klonens für jedes neue DNA-Ziel und die geringe Produktivität des Genomscreenings in bereits zielorientierten Zellen. Biografie Guido Krupp ist CEO und Präsident der Amptec GmbH. Er promovierte an der Universität Würzburg und dem Max-Planck-Institut in Martinsried. Er absolvierte sein Postdoktorat an der Yale University. Er ist Forschungsgruppenleiter an der Universität Kiel. Er ist Gründer der Artus GmbH und der Amptec GmbH. Seine Forschungsinteressen umfassen Nukleinsäuretechnologie mit Schwerpunkt auf RNA, Pflanzenpathogenen (Viroiden), Ribozymen und Telomerasen. Er hat mehr als 60 Publikationen veröffentlicht und ist Herausgeber von Ribozyme Biochemistry & Biotechnology sowie Telomeres, Telomerases & Cancer und Mitglied des Redaktionsausschusses von Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 In der frühen Entwicklungsphase der Genommanipulation stand die Entwicklung spezifischer Zinkfingernukleasen (ZFNs)14 oder Meganukleasen15 im Mittelpunkt der Forschung, um die richtigen DSBs an jeder spezifischen DNA-Zielstelle zu initiieren. Diese Nukleasesysteme erforderten besondere Fähigkeiten, um künstliche Proteine ??zu erzeugen, die aus variabel strukturspezifischen DNA-restriktiven Bereichen bestehen, von denen jeder mit einer vagen Nuklease zur Zielspaltung verbunden ist, was den Wissenschaftlern außergewöhnliche Werkzeuge für die Durchführung genetischer Manipulationen lieferte.16 In der Folge hat eine neue Klasse von Flavobacterium okeanokoites (FokI)-Reaktantenbereichen, die aus bakteriellen Proteinen gewonnen wurden und als Interpretationsaktivator-ähnliche Effektoren (TALEs) bezeichnet werden, Einblicke in weitere Möglichkeiten für die präzise Genombearbeitung gegeben.17 TALE-basierte programmierbare Nukleasen können jede DNA-Gruppe von Interesse mit mäßig hoher Häufigkeit durchtrennen. Ungeachtet dessen sind die grundlegenden Schwierigkeiten bei Ansätzen mit translationsaktivatorähnlichen Effektornukleasen (TALEN) der Plan eines komplexen atomaren Klonens für jedes neue DNA-Ziel und die geringe Produktivität des Genom-Screenings in effektiv auf Zellen ausgerichteten Zellen. Biografie Guido Krupp ist CEO und Präsident der Amptec GmbH. Er erhielt seinen Doktortitel von der Universität Würzburg und dem Max-Planck-Institut in Martinsried. Sein Postdoktorat absolvierte er an der Yale University. Er ist Forschungsgruppenleiter an der Universität Kiel. Er ist Gründer der Artus GmbH und der Amptec GmbH. Seine Forschungsinteressen umfassen Nukleinsäuretechnologie mit Schwerpunkt auf RNA, Pflanzenpathogenen (Viroiden), Ribozymen und Telomerasen. Er hat mehr als 60 Publikationen veröffentlicht und wurde zum Herausgeber von Ribozyme Biochemistry & Biotechnology sowie von Telomeres, Telomerases & Cancer ernannt und ist Mitglied des Redaktionsausschusses von Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 In der frühen Entwicklungsphase der Genommanipulation stand die Entwicklung spezifischer Zinkfingernukleasen (ZFNs)14 oder Meganukleasen15 im Mittelpunkt der Forschung, um die richtigen DSBs an jeder spezifischen DNA-Zielstelle zu initiieren. Diese Nukleasesysteme erforderten besondere Fähigkeiten, um künstliche Proteine ??zu erzeugen, die aus variabel strukturspezifischen DNA-restriktiven Bereichen bestehen, von denen jeder mit einer vagen Nuklease zur Zielspaltung verbunden ist, was den Wissenschaftlern außergewöhnliche Werkzeuge für die Durchführung genetischer Manipulationen lieferte.16 In der Folge hat eine neue Klasse von Flavobacterium okeanokoites (FokI)-Reaktantenbereichen, die aus bakteriellen Proteinen gewonnen wurden und als Interpretationsaktivator-ähnliche Effektoren (TALEs) bezeichnet werden, Einblicke in weitere Möglichkeiten für die präzise Genombearbeitung gegeben.17 TALE-basierte programmierbare Nukleasen können jede DNA-Gruppe von Interesse mit mäßig hoher Häufigkeit durchtrennen. Ungeachtet dessen sind die grundlegenden Schwierigkeiten bei Ansätzen mit translationsaktivatorähnlichen Effektornukleasen (TALEN) der Plan eines komplexen atomaren Klonens für jedes neue DNA-Ziel und die geringe Produktivität des Genom-Screenings in effektiv auf Zellen ausgerichteten Zellen. Biografie Guido Krupp ist CEO und Präsident der Amptec GmbH. Er erhielt seinen Doktortitel von der Universität Würzburg und dem Max-Planck-Institut in Martinsried. Sein Postdoktorat absolvierte er an der Yale University. Er ist Forschungsgruppenleiter an der Universität Kiel. Er ist Gründer der Artus GmbH und der Amptec GmbH. Seine Forschungsinteressen umfassen Nukleinsäuretechnologie mit Schwerpunkt auf RNA, Pflanzenpathogenen (Viroiden), Ribozymen und Telomerasen. Er hat mehr als 60 Publikationen veröffentlicht und wurde zum Herausgeber von Ribozyme Biochemistry & Biotechnology sowie von Telomeres, Telomerases & Cancer ernannt und ist Mitglied des Redaktionsausschusses von Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comDie grundlegenden Schwierigkeiten bei Ansätzen mit translational activator-like effector nucleases (TALEN) sind der Plan eines komplexen atomaren Klonens für jedes neue DNA-Ziel und die geringe Produktivität des Genom-Screenings in effektiv auf Zellen ausgerichteten Zellen. Biografie Guido Krupp ist CEO und Präsident der Amptec GmbH. Er erhielt seinen Doktortitel von der Universität Würzburg und dem Max-Planck-Institut in Martinsried. Sein Postdoktorat absolvierte er an der Yale University. Er ist Forschungsgruppenleiter an der Universität Kiel. Er ist Gründer der Artus GmbH und der Amptec GmbH. Seine Forschungsinteressen umfassen Nukleinsäuretechnologie mit Schwerpunkt auf RNA, Pflanzenpathogenen (Viroiden), Ribozymen und Telomerasen. Er hat mehr als 60 Publikationen veröffentlicht und wurde zum Herausgeber von Ribozyme Biochemistry & Biotechnology sowie von Telomeres, Telomerases & Cancer ernannt und ist Mitglied des Redaktionsausschusses von Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comDie grundlegenden Schwierigkeiten bei Ansätzen mit translational activator-like effector nucleases (TALEN) sind der Plan eines komplexen atomaren Klonens für jedes neue DNA-Ziel und die geringe Produktivität des Genom-Screenings in effektiv auf Zellen ausgerichteten Zellen. Biografie Guido Krupp ist CEO und Präsident der Amptec GmbH. Er erhielt seinen Doktortitel von der Universität Würzburg und dem Max-Planck-Institut in Martinsried. Sein Postdoktorat absolvierte er an der Yale University. Er ist Forschungsgruppenleiter an der Universität Kiel. Er ist Gründer der Artus GmbH und der Amptec GmbH. Seine Forschungsinteressen umfassen Nukleinsäuretechnologie mit Schwerpunkt auf RNA, Pflanzenpathogenen (Viroiden), Ribozymen und Telomerasen. Er hat mehr als 60 Publikationen veröffentlicht und wurde zum Herausgeber von Ribozyme Biochemistry & Biotechnology sowie von Telomeres, Telomerases & Cancer ernannt und ist Mitglied des Redaktionsausschusses von Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com
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