Abstrakt

Biotechnologie-2013: B-cert: Ein Trainingsprogramm für Produzenten gentechnisch veränderter Pflanzen - Ronnie W. Heiniger - North Carolina State University

 Ronnie W. Heiniger

 Die Einführung gentechnisch veränderter Pflanzen, die Proteine ??produzieren, die pharmazeutische Anwendungen zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit oder zur Verringerung von Krankheiten haben, hängt von Produktionssystemen ab, die diese gentechnisch veränderten Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen produzieren können, die verhindern, dass genetisches Material von der Zielpflanze in die Umwelt gelangt. Aufgrund der öffentlichen Besorgnis über den Umgang mit der Biotechnologie in den USA entwickelte das USDA-APHIS das Biotechnology Quality Management System (BQMS)-Programm. BQMS ist ein Bundesprogramm, das den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen durch intensive Aufklärung, Überwachung und Kontrolle aller Aspekte des Prozesses vom Labor bis zum Feld verbessern soll. Das BQMS-Programm hilft Organisationen, die in der biotechnologischen Forschung und Entwicklung tätig sind, darunter kleine Unternehmen und akademische Forscher, die kritischen Kontrollpunkte in ihren Managementsystemen zu analysieren, um die Einhaltung der APHIS-Vorschriften (7 CFR Teil 340) für den Import, den zwischenstaatlichen Transport und die Freisetzung regulierter gentechnisch veränderter Organismen (GE) besser zu gewährleisten. Leider berücksichtigt das BQMS-Programm nicht eines der wichtigsten Glieder im Produktionsprozess – den Anbauer. Um diesen Mangel zu beheben, hat die North Carolina State University in Zusammenarbeit mit dem North Carolina Biotechnology Center und der Northeastern Economic Development Corporation ein Anbauer-Zertifizierungsprogramm namens B-Cert entwickelt. Das B-Cert-Programm vereint die erforderlichen Verfahren zur Verhinderung des Verlusts von genetischem Material am Zielort, die Zertifizierungsstandards und die von USDA-APHIS festgelegten Anforderungen für den Anbau gentechnisch veränderter Pflanzen, um Richtlinien und Standards für Pflanzenmanagement, Isolierungsanforderungen, Gerätehygiene, Umweltschutz, Aufzeichnungspflichten und andere wichtige Prozesse zu entwickeln. Wir haben Viscum in voller Länge in N. tabacum PCPs und N. benthamiana-Blättern in Mengen von bis zu 7 mg/kg gereinigtem Produkt exprimiert. Die Expression der A- und B-Ketten war in beiden Systemen ebenfalls möglich, aber die Ausbeute des heterodimeren Produkts verringerte sich um bis zu 0,97 g/g, während die Expression einer Kette allein keine quantifizierbaren Mengen an rekombinantem Protein ergab. Die Ausbeute an Volldauer-Viscumin war vergleichbar mit der von in Hefe exprimierten Pflanzenlektinen, aber etwa 6-mal niedriger als die von neu gefalteten Viscumin-A- und -B-Ketten, die in E. coli exprimiert wurden. Allerdings ist der bakterielle Prozess komplex, erfordert eine hohe Verdünnung und ist komplex, während die pflanzenbasierte Methode nur die Hälfte der Schritte abdeckt. Laut einem direkten Kostenvergleich zwischen den beiden Methoden ist das pflanzliche Expressionssystem derzeit 50 % günstiger, aber geringfügige Verbesserungen der Ausbeute können die Produktionskosten sogar um bis zu ~88 % senken. Im Vergleich zum nativen Wirt V. album verkürzte die heterologe Expressionsmethode die Vorlaufzeit um mehrere Jahre.verbesserte Eindämmung sowie Raum-Zeit-Ausbeute und erleichterte gezielte Produktmodifikationen. Daher ist die Erzeugung von rekombinantem Viscumin in Pflanzen eine lohnende Gelegenheit für mikrobielle und natürliche Strukturen. Wir exprimierten vorübergehend Volldauer-Viscumin (visFL) unter Verwendung der lokalen 5-Zoll-UTR und der Codierungssequenz, integriert in das Aggregat pTRAc-visFL. Wir haben außerdem die einzelne a-Kette (visA) mithilfe des Konstrukts pTRAc†CHSLPH†visAA†S oder die a-Kette zusammen mit der separaten B-Kette (visB) mithilfe des Konstrukts pTRAc†CHSLPH†visBA†S entweder in N. tabacum mithilfe von†2 PCPs (Abbildung 2a) oder in den Blättern intakter N. benthamiana-Blüten (Abbildung 2b) durch Infiltration mit A. tumefaciens exprimiert. Die Einzelkettenkonstrukte visA und visB trugen ein rekombinantes Signalpeptid zur Sekretion in den Apoplasten intakter Pflanzen oder in die extrazelluläre Region von über 2 Suspensionszellen, um die sofortige Selbstvergiftung des jeweiligen Wirts zu umgehen. Wir entdeckten in allen Proben mittels Western Blot-Analyse 5 Tage nach der Infiltration (dpi) unter Verwendung eines sequenzspezifischen monoklonalen Antikörpers (mAb) TA-5 ein Band von ~30 kDa. Dieses Band wanderte etwas langsamer als das bakterielle nicht glykosylierte Viscum in einem Kettenstandard (~28 kDa). Es entsprach der erwarteten Länge der N-glykosylierten Viscumin-a-Sequenz (~30 kDa), die die Masse des Polypeptids plus 1,9 kDa umfasst, die ein einfaches N-Glycan darstellen, das an eine einzelne erwartete Akzeptorstelle angehängt wurde (Chauhan, Rao & Raghava, 2013). Eine solche Glykosylierung wurde aufgrund vakuolärer Zielsetzung (Strasser, 2014) durch eine interne Signalsequenz des erfahrenen Toxins (Frigerio et al., 2001) erwartet. Die höchste Ausbeute der Viscumin-a-Sequenz im Vergleich zu den anderen Infiltrationseinheiten wurde in den visFL-Proben nachgewiesen. In den PCPs und intakten Blättern betrugen die Verhältnisse visFL:visA + visB:visA für die Ausbeute der Viscumin-A-Serie 6,8:4,0:1,0 bzw. 35:3,5:1,0. In den visFL- und visA + visB-PCP-Proben entdeckten wir außerdem ein ~65 kDa-Band, das der erwarteten Größe eines N-glykosylierten Viscumin-Heterodimers oder eines Serien-Homodimers entspricht, wie bereits zuvor bei E. coli erwähnt (Kourmanova et al., 2004). Neben dem Gendesign (volle Länge vs. einzelne Ketten) könnte auch der Unterschied in Signalpeptiden und 5‘-UTRs die für die drei Expressionskonfigurationen ermittelten a-Sequenzerträge beeinflusst haben (Jansing & Buyel, 2018; Meshcheriakova, Saxena & Lomonossoff, 2014). Niedrige absolute Proteinkonzentrationen könnten auch die Dimererkennung in den visA-Proben verhindert haben. Biografie Ronnie W. Heiniger ist Professor im Fachbereich Pflanzenwissenschaften der North Carolina State University. Er erhielt 1994 seinen Doktortitel in Pflanzenökologie von der Kansas State University.Heiniger hat die letzten 15 Jahre als Forschungs- und Beratungsspezialist am Vernon G. James Research and Extension Center in Plymouth, NC, gearbeitet. Heiniger ist für seine angewandte Forschung bekannt und hat über 30 Zeitschriftenartikel veröffentlicht und Vorträge über seine Arbeit in den Bereichen Präzisionslandwirtschaft und Pflanzenmanagement gehalten. Heiniger wurde von der American Society of Agronomy mit dem Gerold O Mott Award für herausragende Forschung ausgezeichnet und ist Mitglied der Academy of Outstanding Extension Specialists der North Carolina State University.                                                                                                                                                                                                                                                             Ron_Heiniger@ncsu.edu