Abstrakt

Biotechnologie-2013: C-SLGE – Klonen des Saccharomyces cerevisiae-Lipasegens in E. coli nissle 1917 (Probiotikum) – Gadangi Indira – Kakatiya University

 Gadangi Indira

 Lipaseenzyme können den Nährwert von Nahrungsmitteln steigern und spielen eine wichtige Rolle bei der Verdauung, dem Transport und der Verarbeitung von Nahrungslipiden (z. B. Triglyceriden, Fetten, Ölen) in den meisten, wenn nicht allen lebenden Organismen. Escherichia coli Nissle 1917 ist ein sporenbildender probiotischer Mikroorganismus. In einer aktuellen Studie wollten wir das Lipasegen in E. coli Nissle 1917 klonen und exprimieren, um bessere Probiotika zu entwickeln. Das Lipasegen aus Saccharomyces cerevisiae wurde geklont und in den Vektor pUC18 eingefügt und dann durch Transformation in E. coli übertragen. Insertions- und PCR-Analyse von pUC18 aus rekombinantem E. coli Nissle 1917 zeigten das Lipasegenfragment bei der Agarosegelelektrophorese und ergaben eine Größe von fast 1,4 kb. Das in E. coli Nissle 1917 geklonte Lipasegen zeigte eine Lipaseenzymaktivität, während es auf einem mit Lipidquellen angereicherten Medium gezüchtet wurde. Rekombinante E.coli Nissle 1917 wurden auf Testplatten bei unterschiedlichen pH-Werten (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) auf Lipaseaktivität getestet, um eine Veränderung der pH-Spitze des Enzyms im neuen Wirt zu erreichen. Die Lipaseaktivität wurde auf den Platten mit saurem pH-Wert stärker bestimmt als auf den Platten mit normalem pH-Wert, und der pH-Wert mit höchster Qualität wurde mit 6 bestimmt. Der für die Entwicklung der Hefebibliothek gewählte Vektor war das Hybridplasmid YCp5O (Abb. 1). YCp5O enthält den Replikationsstartpunkt von pBR322 und die Gene für Ampr und Tetr. Die Insertion in die BamHI-Stelle von YCp5O ergibt das Plasmid Tets. YCp5O enthält außerdem einen Hefe-Replikator, ARSI, und einen in Hefe selektierbaren Marker, URA3. Anschließend enthält das Plasmid das 1,8 kb große Hefe-CEN4-Fragment, das das Zentromer von Chromosom IV umgibt. Wir entschieden uns für die Verwendung des Centromeren-haltigen Plasmids, da die Transformationshäufigkeiten und die Stabilität der erhaltenen Transformanten höher sind als bei ARS- oder 2,5-μm-haltigen Vektoren. Dies hat den wichtigen Effekt, dass jede der wenigen Hefeänderungen, die zur Identifizierung und Charakterisierung von Genen erforderlich sind, um mindestens einen Tag verbessert wird. Darüber hinaus wussten wir zunächst nicht, ob das CDC8-Gen in hoher Gendosis tödlich sein könnte. YCp5O hat eine Duplikatszahl von 1. Die Bibliothek wurde durch eine geringfügige Änderung des Verfahrens von Nasmyth und Reed (21) erstellt, wie unter Materialien und Techniken beschrieben. Da der Pool mindestens 1,7 x 104 rekombinante Klone enthielt, gibt es in dieser Bibliothek ungefähr sechs Hefegenome. Isolierung von CDC8-haltigen Plasmiden. Bei der Umwandlung von CLK6 ura3 cdc8 ergab DNA, die aus dem Hefe-YCp5O-Hybridpool gewonnen wurde, ungefähr 103 URA+-Transformanten gemäß μg, von denen sich 0,04 % bei der nichtpermissiven Temperatur (37 °C) entwickeln konnten. DNA wurde aus 4 der Hefe-URA‘-CDC‘-Transformanten gewonnen und durch Transformation in Ampicillinresistenz in E. coli übertragen. Plasmid-DNA wurde aus Ampr-Transformanten gewonnen und durch Verdauung mit Restriktionsendonuklease analysiert, beobachtet mittels Agarosegelelektrophorese.Da alle vier Plasmide die gleichen Restenzymkarten hatten, nur das Y, haben wir ein Gen geklont, das CDC8-Mutanten verstärkt und physisch mit dem SUP4-Locus verwandt ist. Die Kartenposition des geklonten Gens bestätigt seine Identität mit dem CDC8-Gen. Die hier beschriebene Bibliothek sollte auch beim Klonen von Genen nützlich sein, die in hoher Dosierung tödlich wären; die Hochfrequenztransformation wird mit dem Centromerenvektor durchgeführt; die intrazelluläre Replikationszahl beträgt jedoch 1. Interessant ist, dass das minimale Fragment, das die CDC8-Mutation ergänzen kann, 750 bp lang ist. Plasmide, die dieses kleine Insert enthalten, konnten sich mit der gleichen hohen Frequenz umwandeln wie Plasmide, die CDC8 enthalten. Plasmid pSU4 wurde mit der Restnuklease BamHI gespalten und das Fragment, das die SUP4- und CDC8-Gene enthält, wurde in Plasmid YCp5O erneut geklont. YCp5O wurde mit BamHI-Endonuklease verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die Ligation von Vektor-DNA in Abwesenheit eines Inserts zu vermeiden. Die Ligationen wurden über Nacht bei 15 °C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase durchgeführt; das Antwortaggregat enthielt 1 μg Vektor-DNA und 0,5 μg pSU4 in 50 μl 66 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,6)-66 mM MgCl2-10 mM Dithiothreitol-1 mM ATP. Es zeigte sich, dass das resultierende Plasmid YCp5O-S4 CDC8 BamHI-Stellen enthielt, und die Ausrichtung des eingefügten Fragments wurde mithilfe einer Restriktionsendonukleaseverdauungsanalyse bestimmt. Da große Abschnitte flankierender DNAs vorhanden waren, scheint es wahrscheinlich, dass dieses Fragment das vollständige CDC8-Gen enthält. Eine solche codierende Region könnte jedoch normalerweise nur ein 27.000 Dalton großes Protein ergeben. Mit Hilfe von Komplementationsassays haben andere das CDC8-Protein bis zur Homogenität gereinigt und ein monomeres Molekulargewicht von 34.000 bis 40.000 ermittelt (1). Es ist daher möglich, dass wir ein Fragment des CDC8-Proteins identifiziert haben, das entweder selbst aktiv ist oder das temperaturempfindliche Protein im Mutanten ergänzt. (Die Möglichkeit, dass das kleine Fragment des Gens bei 370 °C durch ein einzigartiges Merkmal der Rekombination zwischen dem Plasmid und dem mutierten Gen anstelle einer Komplementation Transformanten hervorbringt, wird durch die hohe Transformationshäufigkeit und durch die Tatsache unwahrscheinlich gemacht, dass Zellen, die den URA+-Phänotyp nach Wachstum auf reichhaltigem Medium abgesondert haben, wiederum temperaturempfindlich sind und dass diese Absonderung mit einer Häufigkeit geschieht, die für den Verlust eines autarken Plasmids charakteristisch ist, im Gegensatz zum Fehlen eingeschlossener Plasmide.) Die Nukleotidsequenzierung des kleinen Fragments und die Reinigung des überproduzierten CDC8-Genprodukts aus Zellen, die das CDC8-Plasmid enthalten, sollten diese Fragen beantworten. Biografie Gadangi Indira hat ihren Ph.D. über eine umfassende Erforschung der Dermatophytose im Distrikt Warangal, AP, an der Kakatiya University abgeschlossen und arbeitet derzeit an einem großen, von der UGC finanzierten Forschungsprojekt.Sie ist Leiterin der Abteilung für Mikrobiologie am Pingle Govt UG und PG College in Warangal. Sie hat mehr als 15 Artikel in renommierten Zeitschriften sowie Proceedings nationaler und internationaler Seminare veröffentlicht. gadangi.indira@gmail.com