Abstrakt

Biotechnologie-2013: Kultivierung von Schaf-, Ziegen- und Rinderembryonen verschiedener Qualitätsstufen in TCM-199 und BAF in einem 5 % CO2-Inkubator – Daniel M. Barry – Universität Venda

 Daniel M Barry

Nach der Auswahl von in vivo gezüchteten Nutztierzellen werden diese normalerweise unter hoher Vergrößerung (mindestens 80-fach) mithilfe einer Wandler- oder Audio-Lupe untersucht. Die Zellen der Klasse 1 liefern die besten Entwicklungsergebnisse, wenn sie in synchrone Empfängerweibchen überführt werden, während die Zellen der Klasse 3 die schlechtesten Ergebnisse liefern. Ziel der vorliegenden Studie war es, alle drei Qualitätsbewertungen von in vivo gezüchteten, vorgepressten Zellen im Morula-Stadium von Schafen, Ziegen und Kühen in zwei verschiedenen Kulturmedien zu kultivieren und dann die Entwicklung der Zellen zu untersuchen, indem die Anzahl der Zellen gemessen wird, die das gewachsene Blastozystenstadium erreichen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Entwicklung von unreifen Organismen der Grade 1 und 2 aus keiner der drei Arten gab, wenn sie entweder in TCM-199 oder in hitzeinaktiviertem, ochsenähnlichem Fruchtwasser (BAF) im frühen Schwangerschaftsstadium (<60 Tage) als Kulturmedium verarbeitet wurden. Wesentlich mehr in vivo produzierte unreife Organismen der Grade 3 im vorverdichteten Morula-Stadium von Schafen, Ziegen und Rindern wurden jedoch bis zum inkubierten Blastozystenstadium entwickelt, wenn sie in BAF mit 10 % FBS und Antibiotika verarbeitet wurden, im Vergleich zur Kultur in TCM-199 mit 10 % FBS und Antibiotika (p < 0,05). Materialien und Methoden Zellkultur: OLGs wurden wie bereits beschrieben aus den Gehirnen von 4- bis 6-jährigen Schafen abgetrennt. Frisch isolierte Zellen, Band III (siehe Szuchet et al., 1980, für Einzelheiten) wurden auf Plastikkulturplatten mit 2 x 106 Zellen/ml plattiert. Ungefähr 40 % der Zellen hafteten an der Platte; der Rest der Zellen bildete kleine, schaumige Cluster. Letztere werden als B3.f OLG bezeichnet (Szuchet und Yim, 1984). Nach 4–5 Tagen wurde das Überstand, das B3.f OLG enthielt, gesammelt und zentrifugiert. Die Zellen im Pellet wurden in Kulturmedium resuspendiert und in polylysinbeschichtete Petrischalen umplattiert, an deren Außenseite sich das OLG anlagerte. Letztere Zellen werden als B3 fA (A für Follower) bezeichnet. B3. fA OLG wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium gehalten, das mit 20 % Pferdeserum, 2 mM Glutamin und Antitoxin (0,3 μg/ml Amphotericin B und 2,4 μg/ml Garamycin) angereichert war. Die Kulturen wurden zweimal wöchentlich kontrolliert. Die Reinheit der Kulturen wurde mithilfe einer monoklonalen Immunantwort gegen Galactocerebrosid (ein Geschenk von Dr. B. Ranscht) sowie einer polyklonalen Immunantwort gegen 2',3'-zyklische Nukleotid-3'-Phosphohydrolase (ein Geschenk von Dr. T. Sprinkle) auf 98-99 % bestimmt. Die Zellen wurden 2-4 Tage nach der Implantation getestet. Gesamtzellströme Positive Spannungsschläge vom Haltepotential (-80 mV) lösten einen spannungs- und zeitabhängigen Auswärtsstrom in verfeinerten OLGs aus. Vollständige Zellspannungs-Clipping-Aufzeichnungen einer OLG nach 4 Tagen in der Jüngerkultur finden Sie in Abbildung 2.Der transiente Teil des Stroms wurde bei der depolarisierten Haltekapazität von -40 mV deaktiviert, wodurch ein konstanter Zustandsabschnitt mit variabler Wirksamkeit zurückblieb (Abb. 2B). Abbildung 2C zeigt die Spitzenstrom-Spannungs-Beziehung für die in Abbildung 2, A und B dargestellten Ströme. Insgesamt blieb die Strom-Spannungs-Beziehung für den transienten oder Spitzenstrom nach der Gründung der gesamten Zellanordnung mit der Zeit konstant, was 3-5 Minuten für die anfängliche Anpassung ermöglichte. Die ionische Selektivität des transienten Teils des ausgehenden Stroms wurde aus der Umkehrung der Schwanzströme im Bereich von 5,4 mM außerhalb von K+ aufgelöst. Das Filmpotential wurde zunächst für 10 ms auf 120 mV geändert (Abb. 3A) und dann zu verschiedenen Testoptionen zurückgeführt. Die momentane Strom-Spannungs-Beziehung (5 ms nach Beginn der Schwanzströme) zeigt, dass das Umkehrpotential -66,2 f 1,45 mV betrug (4). Das ermittelte Umkehrpotential für perfekt K+-spezifische Kanäle beträgt -82 mV. Eine Erhöhung des [K] von 5,4 auf 35 mM K+ erhöhte das Umkehrpotential auf -19,8 mV (2). Beweise für die Annahme, dass der spannungsgesteuerte Abwärtsstrom aus mehr als einer Leitfähigkeit besteht, stammen aus der Untersuchung von OLG-Flüssen zu verschiedenen Zeitpunkten in der Kultur. Innerhalb von 48 Stunden nach der Beschichtung begann B3.fA OLG, Prozesse zu entwickeln und spannungsgesteuerte Abwärtsflüsse zu exprimieren. Nach einer Woche in der Kultur schien der vorübergehende Anteil des Abwärtsstroms verringert zu sein. Dieser Rückgang ging häufig mit einer Erhöhung des konstanten oder nicht inaktivierenden Anteils des Abwärtsstroms einher. Darüber hinaus kam es zu einem Anstieg des internen Gleichrichterstroms, wie in Abbildung 9 dargestellt. In einer Reihe von 85 Tests stellten wir fest, dass 88 % (30/34) der Zellen mit Formen nach Tag 7 der Jüngerkultur internen Gleichrichter entwickelten, im Vergleich dazu 18 % (5/28) der Zellen an Tag 1-3 und 26 % (6/23) an Tag 4-7. Der Unterschied in der Häufigkeit des internen Gleichrichters in Zellen vor Tag 7 und nach Tag 7 in der Jüngerkultur war sehr groß (p < 0,001, kontrolliert durch x2-Analyse). Interessanterweise wiesen 57 % (4/7) dieser wenigen Zellen, die nach 14 Tagen in Kultur ohne Formen blieben, gerade Filme mit hoher Barriere auf. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der OLGs wurden mit dem gesamten Zellaufbau der Fixanoden-Spannungsklemmmethode untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen das Vorhandensein eines spannungsabhängigen Auswärtsstroms und eines internen Gleichrichterstroms, die K+-spezifisch sind. Der spannungsgesteuerte Auswärtsstrom stellt aller Wahrscheinlichkeit nach eine zusammengesetzte Reaktion zweier separater Leitfähigkeiten dar. Dies sieht anders aus im Vergleich zu den Berichten von Bevan und Raff (1985) und Bevan et al. (1986), die keine spannungsabhängigen Leitfähigkeiten in OLGs entdeckten. Kettenmann et al. (1984a) beobachteten eine geringe Spannungsabhängigkeit in ihren Einzelkanaluntersuchungen von OLGs (die normale Änderung des PO betrug 0,08 f 0,04 pro 10-mV-Schritt).Eine Rolle von Caz+ bei der Initiierung der K+-Flüsse konnten wir nicht nachweisen, da (1) der Calciumstromblocker Cadmium keinen Einfluss hatte (Brown und Griffith, 1983; Galvan und Sedlmeir, 1984; Beluzzi et al., 1985b).daniel.barry@univen.ac.za