Abstrakt

Biotechnologie 2013: Optimierung der TGE (Transient Gene Expression) mit Pepton-Fütterungsstrategie für die rekombinante Proteinproduktion in Säugetierzellkulturen - Fatemeh Davam Pasteur - Institute of Iran

Fatemeh Davam Pasteur 

 Zusammenfassung: Heute werden fast 60-70 % der rekombinanten Proteine ??erfolgreich in CHO-Zellen produziert. Die Optimierung der zellulären Subkulturbedingungen für Wachstum und Produktivität rekombinanter chinesischer Hamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen) ist ein wichtiger Schritt in der biopharmazeutischen Produktion. Die schnelle Expression des Proteins (kurzfristige Genexpression) TGE ist die bevorzugte Methode, um rekombinante Proteine ??in einem kurzen Zeitraum und in einem für präklinische Tests geeigneten Maßstab zu exprimieren. In der vorliegenden Studie wird der Einfluss der Optimierung der Transfektionsbedingungen in einem serumfreien Medium CD DG44 in einem Schüttelinkubator mit CHO DG44-Zellen in suspendiertem Zustand bewertet. Eine Reihe von Werten für DNA, PEI und Zellsensitivität wurde untersucht, um die besten Werte in Bezug auf die Transfektionseffizienz zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigten, dass die optimierten Werte 1,5 μg/106 Zellen Transfektionsreagenz (PEI), 0,5*106 Zellen für die anfänglichen Zelldichten und 2 μg/106 Zellen DNA mit 28,71, 38,68 bzw. 52,8 % Transfektionsleistung betrugen. Darüber hinaus wurde basierend auf diesen TGE-optimierten Bedingungen die Auswirkung der Fütterung mit sechs exklusiven Soja- und Casein-Peptonen auf die Transfektionsleistung ausgewertet. Die Ergebnisse der Peptonfütterung mit den Peptonen Caseintrypton N1, Soja-Pepton A2Sc und Soja-Pepton E110 zeigten eine Transfektionsleistung von 59,88 %, 58,28 % und 68,66 % mit einer Steigerung von 15,44, 12,35 und 28,55 % im Vergleich zum vorherigen optimierten Verfahren. Diese Fakten deuten darauf hin, dass die richtige Fütterungsmethode die Transfektionsleistung steigern kann und ein vielversprechender Ansatz zur Optimierung des TGE-Prozesses ist. Im letzten Jahrzehnt war TGE eine weit verbreitete Methode zur schnellen Herstellung rekombinanter Proteine ??in Säugetierzellen. Trotz zahlreicher Studien zur Verbesserung dieser Technologie in Bezug auf Skalierbarkeit und Produktivität bleiben die besten TGE-Produktionserträge im Allgemeinen niedriger als die mit stabilen Zellstämmen erzielten Werte. Angesichts der wichtigen Rolle von CHO-Zellen als häufigster Wirt für die Produktion therapeutischer Proteine ??ist eine optimierte TGE-Methode zur Erzeugung ausreichender Mengen rekombinanter Proteine ??für präklinische Untersuchungen wünschenswert. Daher ist es für biopharmazeutische Gruppen nicht erforderlich, ihre präklinische Quellzelllinie rekombinanter Proteine ??für das Endprodukt durch eine andere stabil transfizierte Zelllinie zu ersetzen. Die Transfektionsleistung ist einer der wichtigsten Faktoren, die die TGE-Ergebnisse beeinflussen. Es hat sich gezeigt, dass die Optimierung der Menge des PEI-Transfektionsreagens, der Zelldichte und des DNA-Plasmids hervorragende Auswirkungen auf die Transfektionseffizienz hat. Allerdings wurden die Optimierungsstudien im Allgemeinen an der HEK-Zelllinie durchgeführt (mit höheren Transfektionsraten), und die wenigen Studien an der CHO-Zelllinie haben bisher keine so hohen Werte wie bei HEK-Zellen erreicht. Darüber hinausdie optimierten Bedingungen hängen auch von der Größe und den Eigenschaften des DNA-Plasmids und seiner Kompatibilität mit der Zelllinie ab, daher ist es wichtig, für jedes rekombinante Zielprotein eine optimierte TGE-Methode zu entwickeln. Die während der Transfektion verwendete hohe Zelldichte erhöht die Wahrscheinlichkeit einer zellulären Exposition gegenüber PEI-DNA-Polyplexen, und unter hypothermischen Lebensbedingungen würden die Zellen unter Nährstoffmangel leiden, da sie in einer G1-Phase mit geringerem Nährstoffbedarf blockiert sind. Die kurzfristige Genexpression (TGE) ist eine gut installierte Technologie für die schnelle Produktion von Milligramm- bis Grammmengen rekombinanter Proteine ??in den Zelllinien humaner embryonaler Nieren (HEK) und chinesischer Hamster-Eierstock (CHO) (1–3). Aufgrund des kurzen Umschlags und der hohen Kosten spielt die TGE-Plattform aus zwei Gründen eine wichtigere Rolle in den frühen Entwicklungsphasen der Biopharmazie; erstens ist es für große Biopharmaunternehmen wichtig, mehrere Arzneimittelkandidaten zu testen, bevor sie in die formelle Entwicklungspipeline übergehen. Angesichts der Tatsache, dass CHO-Zellen die vorherrschenden Wirte für die rekombinante Proteinproduktion in der modernen Biopharmaindustrie sind, wäre es sinnvoll, die TGE-Methode für diese Zelllinie zu optimieren, damit man die Daten für eine stabile Zelllinienentwicklung extrapolieren kann. Aufgrund der zahlreichen Risiken, die mit der Verwendung von Serum in Zellkulturen verbunden sind, basieren industrielle Bioprozesse heute hauptsächlich auf serumfreien Medien (SFM) und häufiger auf Medien ohne tierische Zusatzstoffe, die sowohl wirtschaftliche als auch sicherheitstechnische Vorteile gegenüber Produkten tierischen Ursprungs bieten. Die Notwendigkeit, Zusatzstoffe tierischen Ursprungs im Herstellungsprozess zu begrenzen, hat ein Interesse an der Verwendung von Proteinhydrolysaten (Peptone) als alternative Ergänzung zur Serumauffrischung geweckt. Peptone sind wasserlösliche Proteinhydrolysate von chemisch nicht beschriebener Natur, die Peptide, Aminosäuren und anorganische Salze, aber keine Lipide und Zucker enthalten. (11) Diese Kategorie von Medienkomponenten sind kostengünstige, sich gut verkaufende Nährstoffe für die umfangreiche Tierzellkultur, die Nährstoffe oder Nährstoffanaloga basierend auf dem Hydrolysegrad liefern (2, 12). Verschiedene Peptone sind im Handel erhältlich, darunter Extrakte aus Rindergewebe, Fleisch, Kasein, Lactalbumin und Hefe. Der Hauptnachteil der meisten dieser Peptone ist ihr tierischer Ursprung, der die biologische Sicherheit des Mediums gefährdet. Die Ergänzung gängiger proteinfreier Medien mit Peptonen hat zu einem deutlichen Anstieg der TGE-Produktivität in HEK 293-EBNA-Zellen geführt (13, 14). Dieser Effekt wurde auch in CHO-Stammzellstämmen untersucht (15, 16). Nach unserem Kenntnisstand wurde jedoch noch keine Studie durchgeführt, um die Auswirkungen von Peptonpräparaten auf CHO-Zellen bei der vorübergehenden Expression von rekombinantem Protein zu untersuchen. In dieser StudieEs wurden Anstrengungen unternommen, um die beste TGE-Situation in Bezug auf PEI, DNA-Sensitivität und Zelldichte zu ermitteln. Darüber hinaus wurde eine Fütterungsmethode für die rekombinante CHO DG44-Zelllinie angewendet, um eine einzigartige chimäre verkürzte Form des Gewebeplasminogenaktivators zu erzeugen. Neben den in der Arbeit beschriebenen verbesserten TGE-Ausbeuten ist auch erwähnenswert, dass regelmäßiges Passagieren der Zellkultivierung und sanftes Handhaben der PEI-Stammlösung eine entscheidende Rolle beim Erreichen hoher Transfektionseffizienzen und Titer rekombinanter Proteine ??spielen sollten. Darüber hinaus gibt es immer noch Engpässe, darunter die Notwendigkeit eines Medienaustauschs während der Transfektion oder der Zellsensitivität vor der Transfektion, die berücksichtigt werden müssen, um daraus eine praktikable, hochskalierbare Methode zu machen. f.davami@gmail.com