Abstrakt

Euro Biotechnology Congress 2015: Steigerung der Flavonoidproduktion durch systematische Feinabstimmung der zentralen Stoffwechselwege basierend auf einem CRISPR-Interferenzsystem in Escherichia coli – Jingwen Zhou – Jiangnan University

Jingwen Zhou 1,2 , Jianghua Li 1,2 , Junjun Wu 1,2 , Guocheng Du 1,2 und Jian Chen 1,2

Die begrenzte Versorgung mit intrazellulärem Malonyl-CoA in Escherichia coli behindert die biologische Synthese von Polyketiden, Flavonoiden und Biokraftstoffen. Hier wurde ein Clustered Regularly Inter-Spaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Interferenzsystem konstruiert, um die zentralen Stoffwechselwege so zu optimieren, dass der Kohlenstofffluss effizient in Richtung Malonyl-CoA gelenkt wird. Unter Verwendung synthetischer sgRNA zur Stummschaltung von Kandidatengenen wurden Gene als Zielgene verwendet, die den intrazellulären Malonyl-CoA-Spiegel um über 223 % erhöhen konnten. Die Effizienz der Unterdrückung dieser Zielgene wurde angepasst, um geeignete Werte zu erreichen, sodass der intrazelluläre Malonyl-CoA-Spiegel erhöht wurde, ohne die endgültige Biomasseansammlung wesentlich zu verändern (der endgültige OD600-Wert sank um weniger als 10 %). Basierend auf den Ergebnissen war die Stummschaltung mehrerer Gene erfolgreich und näherte sich der Grenze der Menge an Malonyl-CoA, die zur Herstellung des pflanzenspezifischen Sekundärmetaboliten (2S)-Naringenin erforderlich ist. Durch die Kopplung der genetischen Modifikationen an das Zellwachstum erhöhten die kombinierten Effekte dieser genetischen Störungen den endgültigen (2S)-Naringenin-Titer auf 421,6 mg/l, was 7,4-mal höher war als beim Kontrollstamm (50,5 mg/l). Die hier beschriebene Strategie könnte verwendet werden, um Gene zu charakterisieren, die für das Zellwachstum wichtig sind, und um E. coli als gut organisierte Zellfabrik für die Produktion anderer wichtiger Produkte zu entwickeln, die Malonyl-CoA als Vorläufer benötigen, wie Flavonoide, Polyketide und Fettsäuren. Hochfeste Polymere wie Aramidfasern sind wichtige Materialien in der Weltraumtechnologie. Um diese Materialien in abgelegenen Gebieten wie dem Mars zu gewinnen, ist die organische Produktion von Interesse. Der aromatische Polymervorläufer Para-Aminobenzoesäure (pABA) kann aus dem Shikimatweg durch metabolische Manipulation von Bacillus subtilis gewonnen werden, einem für die Weltraumforschung geeigneten Lebewesen. Unsere Konstruktionsstrategie umfasste die Reparatur der fehlerhaften Indol-3-Glycerinphosphat-Synthase (trpC), das Ausschalten eines Chorismatmutase-Isozyms (aroH) und die Überexpression der Aminodesoxychorismatsynthase (pabAB) und Aminodesoxychorismatlyase (pabC) aus den Mikroorganismen Corynebacterium callunae und Xenorhabdus bovienii. Außerdem wurde ein Fusionsprotein-Molekül (pabABC) zur Umleitung des Kohlenstoffübergangs hergestellt. Unter Verwendung flexibler Technologie wurden Varianten des Produktionsstamms, gebrauchsfertige Xylose, hergestellt, um die pABA-Produktionskapazität aus verschiedenen Kohlenstoffquellen zu untersuchen und zu bewerten. Anstelle der Wirksamkeit des Substrats oder der Durchführung des biochemischen Prozesses schien die Toxizität des Produkts, die stark vom pH-Wert abhängig war, der insgesamt einschränkende Faktor zu sein. Der höchste in Schüttflaschen erreichte Titer betrug 3,22 gl−1 bei einer Kohlenstoffausbeute von 12,4 % [C†mol/C†mol] aus einem Aminozucker. Dies garantiert die Eignung des Systems für die In-situ-Ressourcennutzung (ISRU) in der Weltraumbiotechnologie.wo Rohstoffe, die aus Cyanobakterienzelllysat gewonnen werden können, eine Rolle spielen. Kunststoffe und Polymere sind in unserem täglichen Leben allgegenwärtig und sind in der Weltraumtechnologie vielleicht von noch größerer Bedeutung. Biaxial gelagertes Polyethylenterephthalat (BoPET, Handelsname Mylar®) wird für seine hohe Elastizität, Festigkeit und Formbeständigkeit, Widerstandseigenschaften und elektrische Beständigkeit geschätzt; Schichten aus metallisiertem BoPET werden beispielsweise in Höhenexplosionen sowie in Raumanzügen zum Wärmeschutz und zur Strahlenbeständigkeit verwendet. Aramide, wie das Gewebe und der Folienstoff Kevlar®, weisen relativ unterschiedliche Eigenschaften auf, darunter hohe Festigkeit und Elastizitätsmodul, geringe Biegeermüdung sowie hervorragende chemische Beständigkeit und Wärmebeständigkeit sowie Strahlenbeständigkeit. Daher sind sie für eine Reihe von Spezialanwendungen geeignet, einschließlich ballistischem Schutz. Dass diese Materialien besonders für den Bau von Bioanzügen und -unterkünften in der Weltraumtechnologie geeignet sind, zeigt ihre Verwendung in aufblasbaren Raumfahrzeugen wie denen von Bigelow Aerospace® (NASA, 2017). Die Rohstoffe für aromatische Polymere werden normalerweise auf Erdölbasis gewonnen, was weder auf der Erde langfristig möglich noch im Weltraum oder an Zielen wie dem Mond oder dem Mars der Erde verfügbar ist. Metabolic Engineering könnte die Technologie liefern, um dieses Problem zu lösen, indem es die Herstellung von Bioersatzstoffen durch In-situ-Ressourcennutzung (ISRU) ermöglicht. ISRU zielt darauf ab, mithilfe künstlicher Wissenschaft Produkte auf Erkundungsmissionen im Weltraum wiederaufzuladen (Rothschild, 2016). Mikrobielle Stoffwechselwege bieten zahlreiche Möglichkeiten, die möglicherweise derzeit auf Erdöl basierende Chemikalien durch solche auf biologischer Basis ersetzen oder durch biologische Alternativen ersetzen können. Dazu gehören Tausende von Verbindungen, die aus Duftstoffen und Aromastoffen gewonnen werden (Averesch und Krömer, 2018). Die mittlere Para-Aminobenzoesäure (pABA) des Shikimat-Stoffwechselwegs ist einer dieser Aromastoffe mit vielseitiger Relevanz – sie wird als Vernetzungsagent für Säfte und Farbstoffe, als Vorläufer in der Pharmaindustrie und als Heilmittel selbst (z. B. als Medikament POTABA®) verwendet. pABA kann auch in Terephthalsäure (Farlow und Krömer, 2016) umgewandelt werden, die als Ausgangsstoff für die Herstellung von PET/Mylar® dient. Es wäre auch denkbar, pABA in Para-Phenylendiamin umzuwandeln (beispielsweise durch Kochi- oder Hunsdiecker-Reaktion, gefolgt von nukleophilem Ersatz), das (neben Terephthalsäure) das zweite Monomer der Aramidfaser Kevlar® ist. Darüber hinaus kann pABA auch mit sich selbst polymerisiert werden (Morgan, 1977), wodurch möglicherweise ein Para-Aramid mit einer von Kevlar® undifferenzierten subatomaren Struktur entsteht.Die Möglichkeit, pABA mikrobiologisch zu erzeugen und als mechanischer Vorläufer zu verwenden, wurde erstmals mit der Hefe Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen (Krömer et al., 2013), bei der ein Titer von 0,03 gl−1 (0,22 mM) unter Verwendung von Glucose als einziger Kohlenstoffquelle erreicht wurde. In einer speziellen Folgestudie konnte der Titer aus Glycerin/Ethanol auf 0,22 gl−1 (1,57 mM) erhöht werden (Averesch et al., 2016). Darüber hinaus wurden auch Mikroorganismen zur Herstellung von pABA verwendet. In Escherichia coli wurde eine Konzentration von 4,8 gl−1 (35 mM) aus Glucose erreicht (Koma et al., 2014), während die bislang höchste Produktion mit Corynebacterium glutamicum kultiviert wurde und 43,06 gl−1 (314 mM) aus Glucose erreichte (Kubota et al., 2016). Um diese Technologie im Weltraum zu nutzen und letztendlich die Synthese von Aramidfasern zu ermöglichen, wäre es sehr attraktiv, pABA in Bacillus subtilis zu produzieren, dem für die Weltraumforschung am besten geeigneten Lebewesen. Bacillus subtilis bildet Endosporen (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), die gegenüber mehreren biologischen Parametern wie Trockenheit, Salzgehalt, pH-Wert und Lösungsmitteln äußerst resistent sind und über Monate hinweg stabil bleiben; sofern sie vor UV-Strahlung geschützt sind, halten sie sogar dem Vakuum eines Raumes stand (Horneck, 1993). Biografie Jingwen Zhou erhielt 2009 seinen Doktortitel in Fermentationstechnik. Danach wurde er 2009 Assistenzprofessor, 2011 außerordentlicher Professor und 2014 ordentlicher Professor an der School of Biotechnology der Jiangnan University. Von 2012 bis 2013 schloss er seine Postdoc-Ausbildung am Department of Chemistry and Chemical Biology in Harvard ab. Seine derzeitigen Forschungsarbeiten konzentrieren sich hauptsächlich auf die Stoffwechseltechnik von Mikroorganismen zur Herstellung von organischen Säuren und natürlichen Pflanzenprodukten, insbesondere L-Ascorbinsäure und Flavonoiden. Er veröffentlichte 52 von Experten begutachtete Artikel in Zeitschriften wie Metabolic Engineering, Applied and Environment Microbiology sowie mehrere eingeladene Rezensionen in Current Opinion in Biotechnology und Biotechnology Advances. Einige der typischen Produkte, an denen er gearbeitet hat, werden jetzt von mehreren Herstellern im industriellen Maßstab produziert. Seine Leistungen wurden in China mehrfach ausgezeichnet. Derzeit ist er Mitglied des Redaktionsausschusses von Scientific Reports (Nature Press) und des Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).06 gl−1 (314 mM) aus Glucose (Kubota et al., 2016). Um diese Technologie im Weltraum zu nutzen und letztendlich die Synthese von Aramidfasern zu ermöglichen, wäre es äußerst verlockend, pABA in Bacillus subtilis zu erzeugen, dem für die Weltraumforschung am besten geeigneten Lebewesen. Bacillus subtilis bildet Endosporen (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), die gegenüber einigen ökologischen Parametern wie Trockenheit, Salzgehalt, pH-Wert und Lösungsmitteln unglaublich resistent sind und jahrelang lebendig bleiben; sofern sie vor UV-Strahlung geschützt werden, halten sie sogar dem Raumvakuum stand (Horneck, 1993). Biografie Jingwen Zhou erhielt 2009 seinen Doktortitel in Fermentationstechnik. Danach wurde er 2009 Assistenzprofessor, 2011 außerordentlicher Professor und 2014 ordentlicher Professor an der School of Biotechnology der Jiangnan University. Er schloss seine Postdoc-Ausbildung von 2012 bis 2013 am Department of Chemistry and Chemical Biology in Harvard ab. Seine aktuellen Forschungsarbeiten konzentrieren sich hauptsächlich auf die Stoffwechseltechnik von Mikroorganismen zur Herstellung organischer Säuren und natürlicher Pflanzenprodukte, insbesondere L-Ascorbinsäure und Flavonoide. Er veröffentlichte 52 von Experten begutachtete Artikel in Zeitschriften wie Metabolic Engineering, Applied and Environment Microbiology sowie mehrere eingeladene Rezensionen zu Current Opinion in Biotechnology und Biotechnology Advances. Mehrere der typischen Produkte, an denen er gearbeitet hat, werden jetzt von mehreren Herstellern im industriellen Maßstab hergestellt. Seine Leistungen wurden in China mehrfach ausgezeichnet. Er ist jetzt Mitglied des Redaktionsausschusses von Scientific Reports (Nature Press) und Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).06 gl−1 (314 mM) aus Glucose (Kubota et al., 2016). Um diese Technologie im Weltraum zu nutzen und letztendlich die Synthese von Aramidfasern zu ermöglichen, wäre es äußerst verlockend, pABA in Bacillus subtilis zu erzeugen, dem für die Weltraumforschung am besten geeigneten Lebewesen. Bacillus subtilis bildet Endosporen (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), die gegenüber einigen ökologischen Parametern wie Trockenheit, Salzgehalt, pH-Wert und Lösungsmitteln unglaublich resistent sind und jahrelang lebendig bleiben; sofern sie vor UV-Strahlung geschützt werden, halten sie sogar dem Raumvakuum stand (Horneck, 1993). Biografie Jingwen Zhou erhielt 2009 seinen Doktortitel in Fermentationstechnik. Danach wurde er 2009 Assistenzprofessor, 2011 außerordentlicher Professor und 2014 ordentlicher Professor an der School of Biotechnology der Jiangnan University. Er schloss seine Postdoc-Ausbildung von 2012 bis 2013 am Department of Chemistry and Chemical Biology in Harvard ab. Seine aktuellen Forschungsarbeiten konzentrieren sich hauptsächlich auf die Stoffwechseltechnik von Mikroorganismen zur Herstellung organischer Säuren und natürlicher Pflanzenprodukte, insbesondere L-Ascorbinsäure und Flavonoide. Er veröffentlichte 52 von Experten begutachtete Artikel in Zeitschriften wie Metabolic Engineering, Applied and Environment Microbiology sowie mehrere eingeladene Rezensionen zu Current Opinion in Biotechnology und Biotechnology Advances. Mehrere der typischen Produkte, an denen er gearbeitet hat, werden jetzt von mehreren Herstellern im industriellen Maßstab hergestellt. Seine Leistungen wurden in China mehrfach ausgezeichnet. Er ist jetzt Mitglied des Redaktionsausschusses von Scientific Reports (Nature Press) und Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).und auch mehrere eingeladene Rezensionen zu Current Opinion in Biotechnology und Biotechnology Advances. Mehrere der typischen Produkte, an denen er gearbeitet hat, werden jetzt von mehreren Herstellern im industriellen Maßstab hergestellt. Seine Leistungen wurden in China mehrfach ausgezeichnet. Er ist jetzt Redaktionsmitglied von Scientific Reports (Nature Press) und Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).und auch mehrere eingeladene Rezensionen zu Current Opinion in Biotechnology und Biotechnology Advances. Mehrere der typischen Produkte, an denen er gearbeitet hat, werden jetzt von mehreren Herstellern im industriellen Maßstab hergestellt. Seine Leistungen wurden in China mehrfach ausgezeichnet. Er ist jetzt Redaktionsmitglied von Scientific Reports (Nature Press) und Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).   zhoujw1982@jiangnan.edu.cn