Abstrakt

MedChem & CADD 2016: VERO-stabile Zelllinien, die die vollständigen humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren 2 und 3 exprimieren: Plattformen für die subtraktive Phagen-Display

 Akbar Hedayatizadeh-Omran 

Die Wechselwirkung zwischen den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren 2 und 3 (HER2 und HER3) kann möglicherweise zur Therapieresistenz bei Brustkrebs bei Menschen beitragen. Die subtraktive Phagendisplay-Technik ermöglicht eine hochspezifische Selektion von Antikörperfragmenten, die sich gegen HER2 und HER3 auf der Zelloberfläche richten. Die Strategien zur Selektion konformations- und aktivierungsspezifischer Antikörper gegen HER2 und HER3 erfordern streng regulierte HER2- und HER3-exprimierende Zellen, die eine kontrollierte Aktivierung/Inaktivierung dieser Rezeptoren während der Panning-Verfahren ermöglichen. Um dies zu erreichen, haben wir zunächst herausgefunden, dass die VERO-Zelllinie eine geeignete Zelllinie für die heterogene Expression von HER2 und HER3 ist. Anschließend haben wir ein Panel stabiler VERO-Zelllinien erstellt, die hohe Konzentrationen von HER2 und HER3 allein und in Kombination exprimieren. Die hier erstellte Zelllinie bietet nicht nur eine Plattform für Phagendisplay-basierte Methoden, sondern kann auch in allen HER-bezogenen Studien und bei der Arzneimittelentdeckung eingesetzt werden. Der epidermale Wachstumsfaktor ist ein Transmembranprotein und gehört zur ErbB-Rezeptorfamilie, einer Unterfamilie von vier eng verwandten Tyrosinkinaserezeptoren: EGFR (ErbB-1), HER2/neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) und Her 4 (ErbB-4). Bei vielen Krebsarten können Mutationen, die die Expression oder Aktivität von EGFR beeinträchtigen, Krebs verursachen. Eine mangelhafte Signalgebung von EGFR und anderen Rezeptortyrosinkinasen beim Menschen wird mit Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht, während eine Überexpression mit der Entwicklung einer Vielzahl von Tumoren in Verbindung gebracht wird. Eine Unterbrechung der EGFR-Signalgebung, entweder durch Blockierung der EGFR-Bindungsstellen an der extrazellulären Domäne des Rezeptors oder durch Hemmung der Aktivität der intrazellulären Tyrosinkinase, kann das Wachstum von Tumoren, die EGFR exprimieren, verhindern und den Zustand des Patienten verbessern. ErbB2 hat keinen bekannten direkten Aktivierungsliganden und kann sich in einem konstitutiv aktivierten Zustand befinden oder während der Heterodimerisierung mit anderen Familienmitgliedern wie EGFR aktiv werden. EGFR durchläuft bei Aktivierung durch seine Wachstumsfaktorliganden einen Übergang. Es durchläuft einen Übergang von einer inaktiven monomeren Form zu einem aktiven Homodimer. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass vor der Ligandenbindung auch vorgeformte inaktive Dimere vorhanden sein können. Um ein aktiviertes Heterodimer zu bilden, kann EGFR sich mit einem anderen Mitglied der ErbB-Rezeptorfamilie wie ErbB2/Her2/neu paaren, zusätzlich zur Bildung von Homodimeren nach der Ligandenbindung. Die Dimerisierung von EGFR stimuliert seine intrinsische Aktivität der intrazellulären Protein-Tyrosinkinase. In der C-terminalen Domäne von EGFR tritt infolgedessen eine Autophosphorylierung mehrerer Tyrosinreste (Y) auf. Dazu gehören Y992, Y1045, Y1068, Y1148 und Y1173, wie im gegenüberliegenden Diagramm gezeigt. Diese Autophosphorylierung induziert die Aktivierung und die nachfolgende Signalisierung durch mehrere andere Proteine, die sich über ihre eigenen SH2-Domänen, die an Phosphotyrosin binden, mit phosphorylierten Tyrosinen verbinden. Diese nachfolgenden Signalproteine ??initiieren mehrere Signaltransduktionskaskaden, vor allem die MAPK,Akt- und JNK-Signalwege, die zur DNA-Synthese und Zellproliferation führen. Diese Proteine ??modulieren Phänotypen wie Zellmigration, Adhäsion und Proliferation. Die Aktivierung des Rezeptors ist wichtig für die angeborene Immunantwort in der menschlichen Haut. Die Kinasedomäne von EGFR kann auch phosphorylierte Tyrosinreste von anderen Rezeptoren, mit denen sie aggregiert ist, kreuzen und kann selbst auf diese Weise aktiviert werden. EGFR ist für die Gangentwicklung der Brustdrüsen unerlässlich und EGFR-Agonisten wie Amphiregulin, TGF-α und Heregulin induzieren die Gang- und lobuloalveoläre Entwicklung auch in Abwesenheit von Östrogen und Progesteron. Die Identifizierung von EGFR als Onkogen hat zur Entwicklung von Krebstherapien für EGFR (sogenannte „EGFR-Inhibitoren“) geführt, darunter Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Brigatinib und Icotinib für Lungenkrebs und Cetuximab für Dickdarmkrebs. Vor kurzem hat AstraZeneca Osimertinib entwickelt, einen Tyrosinkinasehemmer der dritten Generation. Viele Therapieansätze zielen auf den EGFR ab. Cetuximab und Panitumumab sind Beispiele für Inhibitoren monoklonaler Antikörper. Allerdings ist ersterer vom Typ IgG1, letzterer vom Typ IgG2; die Folgen für die antikörperabhängige Zelltoxizität können sehr unterschiedlich sein. Zalutumumab, Nimotuzumab und Matuzumab sind die anderen monoklonalen Antikörper in der klinischen Entwicklung. Amplifikationen des EGFR-Gens sind die am häufigsten in Glioblastomen gefundenen Amplifikationen. EGFR-Amplifikationen sind in Oligodendrogliomen relativ selten, während die Überexpression des EGFR-Proteins ein häufiges Merkmal von Oligodendrogliomen ist. Reifenberger et al. untersuchten 13 Oligodendrogliome Grad II und 20 anaplastische Oligodendrogliome Grad III auf Amplifikation des EGFR-Gens. Sie beobachteten eine Amplifikation des EGFR-Gens in einem einzigen anaplastischen Tumor. Reifenberger et al. stellten jedoch auch fest, dass eine Überexpression von EGFR-mRNA in Oligodendrogliomen mit niedrigem und hohem Malignitätsgrad relativ häufig ist (sechs von 13 Oligodendrogliomen und zehn von 18 anaplastischen Oligodendrogliomen). Monoklonale Antikörper blockieren die Bindungsdomäne des extrazellulären Liganden. Da die Bindungsstelle blockiert ist, können die Signalmoleküle nicht länger daran binden und die Tyrosinkinase aktivieren. Eine andere Methode verwendet kleine Moleküle, um die EGFR-Tyrosinkinase zu hemmen, die sich auf der zytoplasmatischen Seite des Rezeptors befindet. Ohne Kinaseaktivität kann EGFR nicht aktiviert werden, was eine Voraussetzung für die Bindung von Adapterproteinen weiter unten ist. Durch das Stoppen der Signalkaskade in Zellen, die für das Tumorwachstum auf diesen Weg angewiesen sind, werden Proliferation und Migration anscheinend reduziert. Beispiele für niedermolekulare Kinaseinhibitoren sind Gefitinib, Erlotinib, Brigatinib und Lapatinib (ein gemischter Inhibitor von EGFR und ERBB2). Es gibt mehrere quantitative Methoden, die den Nachweis der Proteinphosphorylierung nutzen, um Inhibitoren der EGFR-Familie zu identifizieren. Neue Medikamente wie Osimertinib, Gefitinib, Erlotinib und Brigatinib zielen direkt auf EGFR ab.Die Patienten wurden in EGFR-positive und EGFR-negative Patienten unterteilt, je nachdem, ob ein Gewebetest eine Mutation zeigt. EGFR-positive Patienten zeigten eine Ansprechrate von 60 %, was die Ansprechrate bei konventioneller Chemotherapie übersteigt, aber viele Patienten entwickeln eine Resistenz. Die T790M-Mutation und das MET-Onkogen sind zwei Hauptquellen der Resistenz. Die häufigste Nebenwirkung von EGFR-Inhibitoren, die bei mehr als 90 % der Patienten auftritt, ist ein papulopustulöser Ausschlag, der sich auf Gesicht und Oberkörper ausbreitet; das Vorhandensein des Ausschlags korreliert mit der Antitumorwirkung des Medikaments. Bei 10 % bis 15 % der Patienten können die Auswirkungen schwerwiegend sein und eine Behandlung erfordern.