Abstrakt

Eine verbesserte Probenvorbereitungsmethode zum Nachweis von Plasmodium falciparum in Blutproben

Thavamani Rajapandi

Die Mikroskopie bleibt der Goldstandard für die Erkennung von Malariaparasiten in Blutproben, während Schnelldiagnosetests (RDTs) und auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Methoden zunehmend für den Einsatz im Feld eingesetzt werden, wobei jede Methode Einschränkungen aufweist. Anhand von in vitro kultivierten Plasmodium-falciparum-Parasitenisolaten haben wir mehrere Methoden zur Probenvorbereitung für die PCR-basierte Erkennung analysiert. Testproben, die einer hypotonen Lyse unterzogen wurden, gefolgt von einer nahezu vollständigen Verarmung von Hämozoin (Hz) und Hämoglobin (Hb) und einer anschließenden PCR-Amplifikation des msp2-Gens, führten zu einer Nachweisgrenze, die im Vergleich zu Proben, die unter isotonischen Pufferbedingungen hergestellt wurden, verbessert war. Darüber hinaus haben wir Sequenzen mehrerer Zielgene amplifiziert, darunter msp2-, msp1-, 18S-rRNA- und eba175-Gene aus Parasitenextrakten, die durch hypotonische Lyse hergestellt wurden. Wir haben einen Primersatz identifiziert, der einen Bereich innerhalb von eba175 amplifizierte, der eine höhere Nachweisgrenze von 1 Parasiten pro 5 × 107 roten Blutkörperchen (RBCs) ergab, sowie einen Primersatz für msp2, der eine Nachweisgrenze von 1 bis 5 Parasiten pro 5 × 107 RBCs durch Standard-PCR-Analyse ergab. Die verbleibenden Ziele wiesen maximale Nachweisgrenzen von 20 bis 30 Parasiten pro 5 × 107 RBCs auf. Diese neu entwickelte Methode ist 100- bis 500-mal empfindlicher als derzeit verfügbare PCR-basierte Methoden, die 30 bis 100 Parasiten pro 5 × 106 RBCs in 1 μl Blut nachweisen. Darüber hinaus könnte diese Methode in der feldtauglichen PCR-basierten Diagnostik sowie zur Parasitengenotypisierung und Qualitätskontrolle fehlgeschlagener RDTs verwendet werden.