Jun-ichi Kadokawa
In diesem Artikel wird eine Untersuchung der enzymatischen Phosphorolyse von α(1→4)-gebundenen Oligo-D-Glucosaminidsubstraten durch thermostabile α-Glucanphosphorylase (aus Aquifex aeolicus VF5)-Katalyse beschrieben. α-Glucanphosphorylase katalysiert je nach Bedingungen sowohl die Phosphorolyse als auch die Glucosylierung/Polymerisation am nichtreduzierenden Ende von α(1→4)-gebundenen Glucosesubstraten. Die Autoren fanden außerdem heraus, dass ein α(1→4)-gebundenes D-Glucosaminidpolymer (Chitosan-Stereoisomer) durch die thermostabile α-Glucanphosphorylase-katalysierte enzymatische Polymerisation von α-D-Glucosamin-1-phosphat aus einer Maltooligosaccharid-Vorstufe gewonnen wurde. In der vorliegenden Untersuchung hoffen wir herauszufinden, ob die Verbindung die Phosphorolyse von Substraten katalysiert, die solche D-Glucosaminidketten enthalten. Die α(1→4)-gebundenen Oligo-D-Glucosaminidsubstrate, die aus Maltotriose gewonnen wurden, wurden zunächst durch die thermostabile, α-Glucanphosphorylase-katalysierte enzymatische Polymerisation von α-D-Glucosamin-1-phosphat aus der Maltotriose-Vorstufe und die anschließende Reinigung durch präparative HPLC hergestellt. Die Phosphorolyse der nachfolgenden Substrate wird im Phosphatpuffer unter dem Blickfeld der thermostabilen α-Glucanphosphorylase gesteuert. Die experimentellen Ergebnisse der Produkte stützten die Entstehung der Phosphorolyse am nichtreduzierenden Ende beider Ketten der D-Glucosamin-α(1→4)-D-Glucosamin- und D-Glucosamin-α(1→4)-D-Glucose-Sequenzen vollständig. Die enzymatische Polymerisation hat sich als hervorragende Methode zur Behandlung von komplexen Polymerisationen erwiesen, die aus gesunden und regiokontrollierten glykosidischen Bindungen bestehen [1-6]. α-Glucan-Phosphorylase ist eine der Chemikalien, die praktisch als Stimulans für die enzymatische Polymerisation zur Herstellung gut charakterisierter Polysaccharide verwendet wurden. α-Glucan-Phosphorylase katalysiert die In-vivo-Phosphorolyse von α(1→4)-Glucanen wie Amylose und Glykogen am nichtreduzierenden Ende in Sichtweite von anorganischem Phosphat (Pi), um α-D-Glucose-1-phosphat (Glc-1-P) zu produzieren. Aufgrund der Reversibilität einer solchen phosphorolytischen Reaktion katalysiert dieser Katalysator auch die Glucosylierung von α(1→4)-Glucan als Glycosylakzeptor, beispielsweise Maltooligosaccharid, in vitro unter Verwendung von Glc-1-P als Glycosylgeber, um eine α(1→4)-glucosidische Bindung mit freigesetztem Pi zu erzeugen. Die reversible Reaktion durch α-Glucan-Phosphorylase-Katalyse lässt sich wie folgt zusammenfassen: [α(1→4)-Glc]n+1+Pi → [α(1→4)-Glc]n+Glc-1-P. Unter den Bedingungen der enormen Geber/Akzeptor-Verhältnisse finden progressive Glucosylierungen am sich verlängernden nichtreduzierenden Ende des Maltooligosaccharids als Basis durch α-Glucan-Phosphorylase-Katalyse statt, was die enzymatische Polymerisation zur Bildung des (1→4)-gebundenen Polysaccharids, d. h. Amylose, auslöst. Der Polymerisationsgrad (DP) von Amylose kann durch das Geber/Akzeptor-Zufuhrverhältnis begrenzt werden. α-Glucan-Phosphorylasen haben eine unterschiedliche Spezifität bei der Erkennung von Substraten gezeigt, abhängig von ihren Quellen.Beispielsweise sind die kleinsten Substrate, die von der am weitesten verbreiteten α-Glucanphosphorylase (Kartoffel-α-Glucanphosphorylase) in Phosphorolyse- und Glucosylierungsreaktionen erkannt werden, normalerweise Maltopentaose (Glc5) und Maltotetraose (Glc4). Andererseits sind Glc4 und Maltotriose (Glc3) die kleinsten Substrate, die von α-Glucanphosphorylase erkannt werden, die aus thermophilen bakteriellen Quellen (thermostabile α-Glucanphosphorylase) in Phosphorolyse- und Glucosylierungsreaktionen isoliert wird. Darüber hinaus ist bekannt, dass α-Glucanphosphorylasen eine schwache Explizitheit bei der Erkennung von Substraten aufweisen, was ebenfalls als von ihren Quellen abhängig angesehen wurde. Kartoffel-α-Glucan-Phosphorylase katalysiert enzymatische Glucosaminylierungen unter Verwendung von α-D-Glucosamin-1-phosphat (GlcN-1-P) und seinem Untergeordneten, N-Formyl-α-D-Glucosamin-1-phosphat (GlcNF-1-P), als nicht-lokale Glycosyl-Gönner in der Essigsäure-Ableitungswiege, um Oligosaccharide mit einer GlcN(F)-Einheit am nichtreduzierenden Ende zu liefern, während progressive Glucosaminylierungen unter Verwendung von GlcN-1-P durch thermostabile α-Glucan-Phosphorylase (aus Aquifex aeolicus VF5)-Katalyse in der Essigsäure-Ableitungswiege erfolgen und α(1→4)-gebundene Oligo-GlcN-Ketten am nichtreduzierenden Ende von Glycosyl-Akzeptoren, z. B. Glc3, dem kleinsten Glycosylakzeptor für diesen Katalysator. Mit zunehmendem Spender/Akzeptor-Zufuhrverhältnis blieben die DP-Werte der α(1→4)-GlcN-Ketten jedoch bei etwa fünf. Dieses Ergebnis zeigte, dass eine weitere Kettenverlängerung durch aus GlcN-1-P gebildetes Pi verhindert wurde, da dies ein natives Substrat für die Phosphorolyse durch α-Glucanphosphorylase-Katalyse ist. Anschließend wurde versucht, Pi als Beschleuniger aus dem enzymatischen Glucosaminylierungsfeld zu entfernen, indem die Reaktion in einem Ammoniumträger (0,5 M, pH 8,5) mit MgCl2 durchgeführt wurde, da die vorherige Verteilung gezeigt hat, dass Pi mit Ammonium- und Magnesiumpartikeln ein unlösliches Salz bildet. Auf diese Weise wurden die fortschreitenden enzymatischen Glucosaminylierungen im Kernsystem beschleunigt, wodurch eine Polymerisation von GlcN-1-P aus der Glc3-Basis stattfand, was zu einem α(1→4)-gebundenen D-Glucosaminid-Polymer führte, das der Struktur eines Chitosan-Stereoisomers ähnelte]. Basierend auf den obigen Ergebnissen haben wir vermutet, dass thermostabile α-Glucan-Phosphorylase die Glucosaminylierung unter Verwendung von GlcN-1-P katalysiert, aber auch die Phosphorolyse am nichtreduzierenden Ende der α(1→4)-gebundenen Glucosaminidkette, abhängig von der Zentralisierung von Pi. Außerdem wurde berichtet, dass thermostabile α-Glucan-Phosphorylase (aus Escherichia coli) je nach Reaktionsbedingungen unterschiedliche synergistische Verhaltensweisen in Bezug auf Phosphorolyse und Glucosylierung zeigte. In der vorliegenden ArbeitWir berichten über die genaue Untersuchung, um herauszufinden, ob thermostabile α-Glucan-Phosphorylase die Phosphorolyse von α(1→4)-gebundenen Oligo-D-Glucosaminide-Maltotriose-Substraten (GlcNm-Glc3) katalysiert. Wir haben ursprünglich die α(1→4)-gebundenen Oligo-D-Glucosaminide-Maltotriose-Substrate für die Phosphorolyse vorbereitet, d. h. die Tetrahexasaccharide (GlcN-Glc3, GlcN2-Glc3 und GlcN3-Glc3), und zwar durch die thermostabile, Phosphorylase-katalysierte enzymatische Polymerisation von GlcN-1-P, wie im Schreibverfahren beschrieben. Das kleinste Substrat, Glc3, wurde als Einführung für die Polymerisation verwendet, um das Auftreten einer Phosphorolyse der Grundlage zu vermeiden, da die Verbindung ihre Phosphorolyse nicht katalysiert. Die Reaktion wurde in einem GlcN-1-P/Glc3-Zufuhrverhältnis von 10:1 in Gegenwart von thermostabiler α-Glucanphosphorylase in einer alkalischen Lösung (pH 8,5) mit Mg2+-Partikeln bei 40 °C für 48 Stunden durchgeführt. In dieser Untersuchung wurde die kürzere Reaktionszeit als die Schreibbedingung (7 Tage) verwendet, um GlcNm-Glc3 mit geringen DP-Werten zu erzeugen. Die MALDI-TOF-MS des Rohprodukts nach der GA-Behandlung zeigt mehrere Spitzenwerte in Bezug auf die subatomaren Massen von Oligosacchariden mit 1–5 GlcN-Einheiten. Dies unterstützt die Bildung des kürzeren GlcNm-Glc3 als die Schreibprodukte (m = ~ 12). Darüber hinaus zeigt das MALDI-TOF-MS-Ergebnis auch kein Auftreten der Exo-Hydrolyse am Glc3-Abschnitt in den durch GA-Katalyse erzeugten Oligosacchariden, was auf die Nähe der GlcN-Ketten am nichtreduzierenden Ende von Glc3 hindeutet. Das HPLC-Chromatogramm nach dem Ausgleich des Produkts mit Salzsäure zeigt die mehreren Spitzen, die sich auf Oligosaccharide mit verschiedenen DPs beziehen. Dementsprechend wurden die Teile einer Spitze A, die sich auf ein Tetrasaccharid bezieht, und der Spitzen B und C, die sich auf Penta- und Hexasaccharide beziehen, durch präparative HPLC gesammelt. Das MALDI-TOF MS des vorherigen und letzten Teils zeigt Spitzen, die sich auf die Atommassen von GlcN-Glc3 und GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3 beziehen, jeweils einzeln, was zeigt, dass das Tetrasaccharid und eine Mischung der Penta- und Hexasaccharide effektiv getrennt wurden.Das MALDI-TOF MS des Rohprodukts nach der GA-Behandlung zeigt mehrere Spitzen in Bezug auf die subatomaren Massen von Oligosacchariden, die ein bis fünf GlcN-Einheiten enthalten. Dies unterstützt die Bildung des kürzeren GlcNm-Glc3 als die Schreibprodukte (m = ~ 12). Darüber hinaus zeigt das MALDI-TOF MS-Ergebnis auch kein Ereignis der Exo-Hydrolyse am Glc3-Abschnitt in den durch GA-Katalyse erzeugten Oligosacchariden, was auf die Nähe der GlcN-Ketten am nichtreduzierenden Ende von Glc3 hindeutet. Das HPLC-Chromatogramm nach dem Ausgleich des Produkts mit Salzsäure zeigt mehrere Spitzen in Bezug auf Oligosaccharide mit verschiedenen DPs. Entsprechend wurden die Bestandteile einer Spitze A, die einem Tetrasaccharid entspricht, und der Spitzen B und C, die Penta- und Hexasacchariden entsprechen, durch präparative HPLC getrennt. Die MALDI-TOF-MS der vorherigen und letzten Bestandteile zeigt Spitzen, die den Atommassen von GlcN-Glc3 und GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3 entsprechen, was zeigt, dass das Tetrasaccharid und eine Mischung aus Penta- und Hexasacchariden erfolgreich getrennt wurden.Das MALDI-TOF MS des Rohprodukts nach der GA-Behandlung zeigt mehrere Spitzen in Bezug auf die subatomaren Massen von Oligosacchariden, die ein bis fünf GlcN-Einheiten enthalten. Dies unterstützt die Bildung des kürzeren GlcNm-Glc3 als die Schreibprodukte (m = ~ 12). Darüber hinaus zeigt das MALDI-TOF MS-Ergebnis auch kein Ereignis der Exo-Hydrolyse am Glc3-Abschnitt in den durch GA-Katalyse erzeugten Oligosacchariden, was auf die Nähe der GlcN-Ketten am nichtreduzierenden Ende von Glc3 hindeutet. Das HPLC-Chromatogramm nach dem Ausgleich des Produkts mit Salzsäure zeigt mehrere Spitzen in Bezug auf Oligosaccharide mit verschiedenen DPs. Entsprechend wurden die Bestandteile einer Spitze A, die einem Tetrasaccharid entspricht, und der Spitzen B und C, die Penta- und Hexasacchariden entsprechen, durch präparative HPLC getrennt. Die MALDI-TOF-MS der vorherigen und letzten Bestandteile zeigt Spitzen, die den Atommassen von GlcN-Glc3 und GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3 entsprechen, was zeigt, dass das Tetrasaccharid und eine Mischung aus Penta- und Hexasacchariden erfolgreich getrennt wurden.
English 
Spanish 
Chinese 
Russian 
French 
Japanese 
Portuguese 
Hindi