Abstrakt

In Organischer Chemie 2018: Chemische Werkzeuge zur Untersuchung der Protein-Ubiquitinierung - Jun Yin

 Jun Yin Außerordentlicher Professor, Georgia State University, USA

 Ubiquitin (UB) wird durch eine E1-E2-E3-Enzymkaskade auf die Substratproteine ??übertragen, um deren Stabilität und biologische Funktionen in der Zelle zu regulieren. Das menschliche Genom kodiert 2 E1s, 45 E2s und mehr als 600 E3s. Zusammen bilden sie ein komplexes UB-Transfernetzwerk zur Modifikation zellulärer Proteine. Derzeit sind wichtige Fragen ungelöst, wie man Ubiquitinierungsziele wichtiger E3s identifiziert, um sie den Signalnetzwerken der Zelle zuzuordnen, und wie UB-Ketten mit spezifischen Verknüpfungen zusammengesetzt werden, um einzigartige Signale in der Zelle zu kodieren. Wir haben eine Methode entwickelt, die wir als „oeorthogonalen UB-Transfer“ (OUT) bezeichnen, um die Komplexität der Protein-Ubiquitinierungsnetzwerke zu entwirren. Der Schlüssel zu OUT besteht in der Entwicklung einer Kaskade aus veränderten E1-, E2- und E3-Enzymen (xE1, xE2 und xE3), die ausschließlich ein verändertes UB (xUB) auf die Substrate eines xE3 überträgt. Wir exprimieren xUB und die OUT-Kaskade in der Zelle, reinigen xUB-konjugierte Proteine ??und enthüllen ihre Identität durch Proteomik. Die Proteine ??aus dem OUT-Screen sind die potenziellen Substrate des E3 in der OUT-Kaskade. Wir haben OUT-Kaskaden mit HECT E3 E6AP und U-Box E3s E4B und CHIP entwickelt und neue zelluläre Schaltkreise identifiziert, die durch diese E3s reguliert werden. Um den Mechanismus der E2-katalysierten UB-Kettensynthese zu untersuchen, haben wir durch Einbau unnatürlicher Aminosäuren und Ligation exprimierter Proteine ??bindungsspezifische Di-UB-Konjugate erzeugt. Die Di-UB-Konjugate ahmen die Bindungsmodi von Donor- und Akzeptor-UBs am aktiven Zentrum E2 für die UB-Kettensynthese nach. Durch die Charakterisierung der Struktur von E2-DiUB-Konjugaten werden wir aufdecken, wie E2 die Synthese von UB-Ketten mit unterschiedlichen Verknüpfungen reguliert. Ubiquitin (Ub) ist ein kleines (8,6 kDa) regulatorisches Protein mit 76 Aminosäuren, das eine β-Griff-Faltung annimmt. Ub ist in eukaryotischen Organismen stark konserviert. Die Konjugation von Ubiquitin an ein Zielprotein wird als Ubiquitinierung oder Ubiquitylierung bezeichnet.1 Normalerweise wird Ub über eine Isopeptidbindung zwischen dem C-terminalen Carboxylat von Ubiquitin (Glycin 76) und einer ε-Aminogruppe eines Lysinrests in den Akzeptorproteinen an Proteine ??gebunden. Die Ubiquitinierung ist eine wichtige, reversible posttranslationale Modifikation (PTM) in eukaryotischen Zellen. Seit ihrer Entdeckung in den späten 1970er und frühen 1980er Jahren hat sich die Modifikation durch Ubiquitin als wichtiger Regulationsmechanismus in den meisten zellulären Prozessen bei Eukaryoten herausgestellt. Die Ubiquitinierung beeinflusst Substratproteine ??auf viele verschiedene Arten, einschließlich Signalisierung, proteasomaler Abbau, Veränderung der zellulären Lokalisierung, Modulation der katalytischen Aktivität und Förderung oder Verhinderung von Proteininteraktionen.2, 3 Zu den durch Ubiquitinierung regulierten zellulären Prozessen gehören Zellzyklus, Transkription, Transport, Entzündung und DNA-Reparatur. Bemerkenswerterweise sind viele der Prozesse unabhängig vom proteasomvermittelten Proteinabbau. Die Ubiquitinierung umfasst drei enzymatische Hauptschritte, die durch Ubiquitin-aktivierende Enzyme (E1), Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2) katalysiert werden.und Ubiquitinligasen (E3) (siehe Abb. 1).5 Zunächst wird Ubiquitin in einer zweistufigen Reaktion durch ein E1 (Ubiquitin-aktivierendes Enzym) unter Verbrauch von ATP aktiviert, wobei ein Ubiquitinadenylat-Zwischenprodukt und anschließend eine Thioesterbindung zwischen der C-terminalen Carboxylgruppe des Ubiquitins und dem Cystein von E1 gebildet wird. Das menschliche Genom enthält zwei E1, nämlich UBA1 und UBA6.8 E2 katalysiert den Transfer von Ub vom Ub-E1-Konjugat zum Cystein von E2 und bildet das Ub-E2-Konjugat durch eine Transthioesterifizierungsreaktion. Das menschliche Genom enthält über 30 verschiedene E2-Enzyme. Die E3-Ubiquitinligase katalysiert den letzten Schritt der Ubiquitinkaskade, indem sie Ub vom Ub-E2-Konjugat auf das Substratprotein überträgt. E3s sind substratspezifisch für die E2-Enzyme. Die Cullin-RING-Ligasen, die die wichtigste Gruppe der E3s bilden (etwa 600 Mitglieder), bilden keine chemische Bindung mit Ub. Zwei kleinere Gruppen von E3s, die HECT-Ligasen (etwa 30 Mitglieder) und RBR-Ligasen (etwa 12 Mitglieder), bilden ein Ub-Thioester-Intermediat mit dem E3-Stellen-Cystein